Jonizacja Wody w Biotechnologii: Zastosowania Spektrometrii Mas
- Szczegóły
Spektrometria mas jest techniką analityczną, która w ciągu ostatniego stulecia uległa dynamicznemu rozwojowi. Począwszy od skonstruowania pierwszego spektrometru przez Josepha Johna Thomsona w 1911 roku do czasów współczesnych przeszła długą drogę doskonalenia, dzięki czemu dziś jest cenioną techniką pozwalającą na identyfikację związków chemicznych oraz precyzyjne określenie składu złożonych struktur. Do zasadniczego postępu w tym kierunku przyczyniło się powstanie nowych metod łagodnej jonizacji próbek biologicznych, które znalazły zastosowanie w proteomice, metabolomice oraz chemii materiałów i polimerów.
Techniki LDI w Spektrometrii Mas
Techniki LDI wykorzystujące proces transferu energii zostały wprowadzone w późnych latach 60 ubiegłego wieku jako obiecująca perspektywa badania biocząsteczek umiejscowionych na powierzchni płytki. Istotą tego mechanizmu jest wprowadzenie stałego lub ciekłego analitu w stan gazowy przy użyciu wiązki laserowej, a następnie nadanie obojętnym cząsteczkom wymaganego ładunku.
Wszystkie metody oparte na LDI zalicza się do tzw. metod miękkiej jonizacji, co oznacza, że poddawane badaniu molekuły w głównej mierze przekształcane są w pojedynczo naładowane jony molekularne, a fragmentacji ulegają jedynie w niewielkim stopniu. Techniki LDI są szczególnie atrakcyjne ze względu na dużą czułość oznaczeń (na poziomie femtomolowym), tolerancję na zanieczyszczenia oraz niewielką ilość próbki potrzebną do przeprowadzenia analiz, co w przypadku cennego materiału ogranicza jego straty.
1. MALDI (Laserowa Desorpcja/Jonizacja Wspomagana Matrycą)
MALDI (ang. Laserowa desorpcja/jonizacja wspomagana matrycą) jest najbardziej znaną i najczęściej stosowaną metodą do badania nielotnych, wielkocząsteczkowych, delikatnych cząsteczek biologicznych. Została ona opracowana pod koniec lat 80 z myślą o śledzeniu zawartości białek, peptydów, węglowodorów i nici DNA.
Klasyczna procedura MALDI rozpoczyna się od powlekania analitu roztworem matrycy. Mieszaninę sporządza się z dużym naddatkiem molowym związku matrycowego (stosunek 1:1000-1:100 000), aby mógł on efektywnie ochronić molekuły przed destruktywnym działaniem promieniowania. Po odparowaniu rozpuszczalnika i współkrystalizacji matrycy i analitu gotową do pomiaru próbkę umieszcza się we wnętrzu spektrometru i poddaje się ją krótkim impulsom lasera.
Przeczytaj także: Profesjonalna stylizacja włosów w domu
Matryca silnie absorbuje wyemitowane promieniowanie i na skutek powstałej energii termicznej odparowuje z powierzchni razem z analizowaną substancją (desorpcja). W fazie gazowej dochodzi do dysocjacji matrycy i tworzenia się jonów (głównie H+, Na+, K+), które łączą się z cząsteczkami analitu i matrycy - zachodzi jonizacja. Naładowane cząsteczki są przyspieszane w polu elektrycznym i trafiają do detektora.
Do tradycyjnych związków matrycowych używanych w MALDI należą substancje organiczne posiadające wysoki współczynnik absorpcji UV, tj. krystaliczne pochodne kwasu benzoesowego (DHB) i cynamonowego (SA, CHCA) oraz jonowe kwasy i zasady. Doskonałe zdolności pochłaniania promieniowania są wynikiem posiadania przez matryce reszt chromoforowych. W obecności pierścieni aromatycznych większa część energii zostaje przechwycona przez cząsteczki matrycy, a analit jest zabezpieczony przed niepożądanym rozpadem.
Najczęściej obserwowanymi jonami na widmach MALDI są pojedynczo naładowane dodatnie ([M+H]+, [M+Na]+, [M+K]+) i ujemne jony molekularne [M-H]- , natomiast jony wielokrotnie naładowane typu [M+nH]n+ i [nM+H]+ są spotykane rzadziej. Promowanie występowania jonów jednokrotnie naładowanych jest związane ze zjawiskiem wzajemnej neutralizacji zachodzącym wewnątrz zdesorbowanej mieszaniny matrycy i analitu. Szybkość zobojętnienia jest tym większa im wyższy jest początkowy ładunek jonu, dlatego też cząsteczki o pojedynczym ładunku są mniej podatne na ten proces i mają większe szanse przetrwania.
2. SALDI (Surface Assisted Laser Desorption/Ionization)
W roku 1995 Sunner i Chen rozwinęli badania nad nieorganicznymi matrycami do analiz metodą LDI. Dostrzegli duży potencjał chemicznie obojętnych cząstek grafitu i wykorzystali je do identyfikacji peptydów i białek. Zapoczątkowali tym samym wdrożenie nanomateriałowych powierzchni w miejsce konwencjonalnych, kłopotliwych matryc organicznych. Nanomateriałami określa się regularne struktury złożone z jednostek nie przekraczających 100 nm.
Posiadają one szereg właściwości, które pozwoliły na sprzężenie z LDI:
Przeczytaj także: Wszystko o prostownicy z laserową jonizacją
- Wysoki współczynnik absorpcji promieniowania lasera;
- Duży stosunek powierzchni do objętości;
- Prosta procedura przygotowania próbki;
- Homogeniczny rozkład analitu;
- Połączenie z analitem w oparciu o fizyczne i chemiczne powinowactwo;
Krystaliczne powierzchnie spełniają taką samą rolę jak matryce w MALDI, ale mechanizmy odpowiadające za desorpcję i jonizację są zgoła inne. Wzbudzenie powierzchni przebiega na zasadzie wytworzenia pary elektron-dziura (półprzewodniki) lub przez zajście powierzchniowego rezonansu plazmonowego, a efektywność zależy od jej budowy morfologicznej, stopnia porowatości oraz wielkości nanocząstek. Po dokonaniu transferu energii istnieje możliwość połączenia się analitu z protonem (jeżeli taki występuje na powierzchni materiału), po czym zjonizowany analit ulega desorpcji.
Za źródło czynników protonowych wzbogacających powierzchnię uważa się zaadsorbowane z powietrza węglowodory. W przypadku, gdy nanowarstwa nie posiada związanych donorów protonowych cząsteczki substancji badanej uzyskują ładunek po przejściu w fazę gazową w wyniku kolizji z kationami metali.
Oprócz czynników termicznych i stanów elektronowych na jakość procesu desorpcji i jonizacji wpływa także obecność rozpuszczalnika. Dowiedziono, że polarne grupy substancji rozpuszczającej stabilizują molekuły analitu poprzez solwatację i dostarczają dodatkowych protonów. Cząsteczki wody pomagają neutralnym analitom przejść w formę jonową, zwłaszcza gdy proces przebiega na monokrystalicznej warstwie w niskiej temperaturze, natomiast dodatek ciekłego glicerolu poprawia czułość detekcji i zapobiega nadmiernej fragmentacji.
3. DIOS (Desorption/Ionization on Silicon)
Technika ta jest jedną z najczęściej stosowanych metod w identyfikacji peptydów, węglowodorów, kwasów i soli organicznych, związków metaloorganicznych. Stała się także ważnym narzędziem w wykrywaniu nielegalnych narkotyków, np. Porowate płytki krzemowe uzyskuje się na drodze elektrochemicznego wytrawiania krystalicznego krzemu w alkoholowym roztworze kwasu fluorowodorowego. Dostosowanie kształtu, wielkości i głębokości porów jest istotnym zadaniem, gdyż wpływa na przebieg procesu. Optymalne wyniki uzyskuje się przy średnicy porów 50-100 nm i głębokości 400-700 nm.
Powstające w wyniku wytrawiania reszty Si-H czynią warstwę silnie hydrofobową i są dobrym źródłem protonów potrzebnych do jonizacji. Niekiedy powłokę poddaje się aktywacji poprzez zastąpienie grup silanowych resztami silanolowymi (Si-OH), które wspomagają jonizację. Porowaty krzem posiada dużą powierzchnię aktywną do łączenia się z analitem i nie generuje sygnałów pochodzących od tła, co stwarza doskonałe warunki do analizy niskocząsteczkowych związków.
Przeczytaj także: Pyły zawieszone, filtry i jonizacja w oczyszczaczach powietrza
Główną wadą metody jest trwałość materiału. Ugrupowanie znajdujące się na powierzchni są podatne na utlenianie i wrażliwe na zanieczyszczenia, dlatego ich przydatność jest ograniczona do 1 roku od momentu wyprodukowania.
Obrazowanie Tkanek Zwierzęcych przy Pomocy Spektrometrii Mas (MSI)
Istotą obrazowania jest wizualizacja rozkładu przestrzennego związków pochodzenia biologicznego i syntetycznego w badanym materiale biologicznym. Zestaw danych otrzymany metodą MSI jest wynikiem powiązanych ze sobą składowych, wśród których wyróżniamy: położenie punktu na powierzchni (x,y), stosunek masy do ładunku (m/z) oraz intensywność (I).
Zasadniczo w tej technice można wyróżnić dwa etapy: mapowanie i tworzenie obrazu. Pierwszy z nich polega na zebraniu informacji dotyczących rozmieszczenia analitu w poszczególnych fragmentach materiału badanego. Energia pochodząca z lasera powoduje przejście cząsteczek biologicznych w stan gazowy, gdzie ulegają jonizacji i rozdzielane są zgodnie z ich stosunkiem m/z w spektrometrze masowym.
Do separacji zjonizowanych cząstek najczęściej stosuje się analizator czasu przelotu ToF (ang. Time-of-Flight). W wyniku stopniowego przemieszczania się lasera po tkance zbierane są widma masowe - uzyskuje się tysiące punktów pomiarowych w postaci plam, które zawierają sygnały analizowanych związków o różnej intensywności.
Niezwykle atrakcyjnym aspektem obrazowania jest jego efektywność. Już podczas jednego eksperymentu jesteśmy w stanie uzyskać szczegółowe, rzetelne informacje na temat lokalizacji cząsteczek, istniejących modyfikacji potranslacyjnych, a także ustalić skład ilościowy danego związku. Doskonała czułość pozwala na wykrywanie substancji na poziomie femtomolowym (10-15 mola), a więc potwierdza nawet śladową obecność cząsteczek.
W porównaniu z innymi metodami obrazowania, MSI nie wymaga uprzednich kroków związanych ze żmudnym oczyszczaniem i separacją. Metoda MSI stała się potężnym narzędziem wykorzystywanym w analizie złożonych układów biologicznych takich jak pojedyncze komórki czy tkanki w środowisku in vivo, in vitro i in situ. Obrazowanie w obrębie tych struktur pozwala na identyfikację związków o różnym pochodzeniu tj. leków, metabolitów, węglowodanów, białek, peptydów, lipidów a także polimerów, co jest osiągalne poprzez możliwość analizy w szerokim zakresie mas rozpoczynając od atomów i substancji niskocząsteczkowych po duże makromolekuły.
Metody LDI sprzężone ze spektrometrią mas z powodzeniem znajdują zastosowanie w badaniu budowy i występowania syntetycznych związków chemicznych i molekuł wchodzących w skład złożonych układów biologicznych tj. tkanki, krew, osocze, mocz.
tags: #jonizacja #wody #biotechnologia #zastosowania
