Hodowla odwrotna: Definicja i zastosowanie w biologii molekularnej
- Szczegóły
W ostatnich latach w badaniach molekularnych organizmów żywych bardzo popularna stała się analiza transkryptomu, która umożliwia poznanie profilu ekspresji genów w komórkach. Zgłębienie różnic między komórką zdrową i tą, w której ekspresja genów jest zaburzona, umożliwia ustalenie mechanizmów różnych chorób, w tym powszechnie dziś występujących nowotworów [51,52].
Podstawy analizy transkryptomu
Określenie podstawowego poziomu ekspresji genów w zdrowych tkankach jest niezbędne w analizie i interpretacji wyników pozyskanych z tkanek patologicznych.
Technika real-time RT-PCR
Techniką stosowaną najczęściej w tego typu analizie jest odwrotna transkrypcja (reverse transcription - RT) poprzedzająca łańcuchową reakcję polimerazy z obrazowaniem w czasie rzeczywistym (real-time polymerase chain reaction), dalej zwana w skrócie metodą real-time RT-PCR. Metoda ta zrewolucjonizowała możliwość detekcji mRNA, pozwalając na wykrycie nawet jednej kopii transkryptu [36]. Jej użycie do ilościowego oznaczania ekspresji genów umożliwia diagnozowanie chorób nowotworowych, wybór odpowiedniej terapii i monitorowanie odpowiedzi organizmu na leczenie [8]. Sama technika real-time PCR w onkologii służy także do określania zmian na poziomie chromosomów (translokacje, powstawanie genów fuzyjnych) oraz szacowania zaawansowania choroby.
Zastosowanie metody realtime RT-PCR, pozwalającej na obserwację procesu powielania materiału genetycznego w czasie rzeczywistym, umożliwia szybkie i dokładne wykonanie pomiaru ilości materiału genetycznego obecnego w próbie.
Etapy pomiaru liczby transkryptów metodą real-time PCR
Pomiar liczby transkryptów metodą real-time PCR jest procedurą składającą się zasadniczo z 3 etapów. Po przygotowaniu tkanki następuje kolejno: izolacja mRNA, odwrotna transkrypcja oraz amplifikacja cDNA przy jednoczesnej detekcji ilości powstającego produktu.
Przeczytaj także: Utrzymywanie wilgotności w hodowli komórkowej
Systemy jedno- i dwustopniowe real-time RT-PCR
Na rynku biotechnologicznym obecne są systemy do jedno- i dwustopniowej real-time RT-PCR. Jednostopniowa (one-step lub onetube real-time PCR) umożliwia przeprowadzenie odwrotnej transkrypcji i amplifikacji w jednej probówce. Ze względu na zmniejszenie w tym przypadku liczby wykonywanych czynności, ryzyko zanieczyszczenia próby lub utraty materiału jest mniejsze [5]. W dwustopniowej reakcji (two-step lub two-tube real time PCR) najpierw jest przeprowadzana odwrotna transkrypcja, a otrzymana próba jest następnie przenoszona do kolejnych probówek w celu wykonania PCR. Odseparowanie tych dwóch procesów pozwala na łatwiejszą optymalizację reakcji i uzyskanie lepszych rezultatów w przypadku analizowania kilku różnych transkryptów dla jednej próby.
Stadium powielania badanego materiału genetycznego
Etapem charakterystycznym dla real-time RT-PCR jest stadium powielania badanego materiału genetycznego z obrazowaniem w czasie rzeczywistym. Proces ten jest możliwy dzięki zastosowaniu barwników fluorescencyjnych. Aparat przeprowadzający reakcję mierzy zmiany we fluorescencji badanej próbki i na tej podstawie wyznacza ilość powstającego produktu w kolejnych cyklach. Najpopularniejszym barwnikiem w reakcjach real-time jest SYBR Green I, który wiąże się do dwuniciowego DNA, przez co jego fluorescencja wzrasta prawie 1000-krotnie (im więcej powstanie produktu tym większa będzie fluorescencja próbki).
Wadą tego układu jest, oprócz braku możliwości analizowania kilku genów w jednej mieszaninie reakcyjnej, nieswoistość wiązania, w wyniku czego wykrywane mogą być wszystkie sekwencje dwuniciowe (np. dimery starterów czy nieswoiste produkty amplifikacji). Dlatego, oprócz krzywej wzrostu fluorescencji, na końcu reakcji z SYBR Green I analizuje się krzywą topnienia, która pozwala określić czystość uzyskanego DNA [23]. Bardziej swoistą analizę przeprowadzić można z użyciem sond molekularnych, które przyłączają się do konkretnej sekwencji na matrycy [1]. Połączone z sondami barwniki emitują w procesie fluorescencji światło, którego ilość wzrasta proporcjonalnie do ilości produktu.
Cykl reakcji, przy którym fluorescencja próby przekracza linię graniczną (threshold), ustaloną automatycznie lub przez operatora, definiowany jest jako Ct (cycle threshold) lub odpowiednio Cp (crossing point, w przypadku urządzenia LightCycler firmy Roche) [8]. Ct mierzone jest w fazie logarytmicznego wzrostu ilości DNA i im jego wartość jest mniejsza tym większe było stężenie matrycy na początku reakcji.
Normalizacja wyników
Podczas kolejnych etapów przygotowywania próby w celu oznaczenia liczby transkryptów badanych genów, może jednak dochodzić do zmian ilości materiału genetycznego, których najczęstszą przyczyną jest różna wydajność izolacji mRNA oraz odwrotnej transkrypcji w poszczególnych próbach. Stąd potrzeba normalizacji wyników między analizowanymi próbami, poprzez wykorzystanie genu referencyjnego (normalizującego). Oznaczanie ilościowe, najczęściej w odrębnych reakcjach, genu badanego i normalizującego w danej próbie daje pewność, że wszelkie zmiany w ilości materiału genetycznego podczas badania dotyczą w takim samym stopniu obydwu genów.
Przeczytaj także: Zapotrzebowanie na wodę w hodowli
Oznaczenie poziomu ekspresji genów wiąże się z izolacją mRNA, odwrotną transkrypcją i amplifikacją cDNA. Różne wydajności wymienionych procesów w poszczególnych próbkach oraz nieunikniona w ich trakcie utrata materiału genetycznego mogą nastręczać wiele trudności i prowadzić do błędnych wyników. Aby zapobiec tego typu błędom, stosuje się normalizację liczby transkryptów badanego genu w stosunku do liczby transkryptów genu metabolizmu podstawowego [1,28,41]. 2-mikroglobuliny (B2M) oraz geny 18S i 28S rybosomalnego RNA (rRNA) [23].
Gen referencyjny
Aby gen referencyjny był dogodnym wzorcem, w stosunku do którego można oznaczać ilości mRNA innych genów, musi charakteryzować się stałym, nieregulowanym poziomem ekspresji w danej tkance. Geny metabolizmu podstawowego, uznawane za spełniające ten warunek, są powszechnie stosowane jako geny normalizujące. Badania ich ekspresji wykazały jednak istniejące różnice w liczbie transkryptów w tkankach zdrowych i zmienionych chorobowo, oraz zmiany ekspresji genów metabolizmu podstawowego w tkankach pod wpływem podawanych leków i innych substancji chemicznych.
Gen wykorzystywany do normalizacji powinien prezentować wiele właściwości, dzięki którym otrzymany wynik będzie dokładny. Te cechy to stały poziom ekspresji w danym rodzaju tkanki, niezależnie od warunków doświadczalnych i stanu chorobowego, oraz zbliżona liczba transkryptów w stosunku do liczby transkryptów genu badanego [28,46]. Jeżeli powyższe warunki są spełnione, ilość poddawanego badaniu mRNA nie stanowi najważniejszego problemu w analizie, a dokładność stosowanej metody zależy jedynie od zmian w wydajności amplifikacji obu genów.
Definicja genów metabolizmu podstawowego (housekeeping gene - HKG) określa je jako geny zaangażowane w procesy najistotniejsze dla przeżycia komórki, które ulegają ekspresji na stosunkowo stałym, nieulegającym zmianom poziomie we wszystkich tkankach organizmu [9,22,23,54].
Wiele eksperymentów wykorzystujących normalizację liczby transskryptów w stosunku do genów metabolizmu podstawowego zakłada, że poziom ekspresji tych genów nie ulega zmianie [23,42].
Przeczytaj także: Sterowniki i usterki ASUS K52J
Bazy danych genów metabolizmu podstawowego
Informacje na temat genów HKG zebrano w ogólnodostępnych bazach danych. Najobszerniejsza z nich - „The Friendly Alternative Splicing and Transcripts Data Base” (Fast DB) [10] zawiera obecnie informacje o 720 genach metabolizmu podstawowego. Zamieszczone zostały tam także dane dotyczące struktury i położenia genów na chromosomie, różne postacie transkryptów genów wynikające z alternatywnego składania (alternative splicing) oraz liczba ich transkryptów w poszczególnych tkankach. Kolejna baza danych - „Human Gene Expression Index” (Huge Index), stworzona została dzięki wynikom uzyskanym z analizy ekspresji genów z użyciem mikromacierzy [20]. W bazie tej opisano 452 geny metabolizmu podstawowego.
Dane zamieszczone w ww. źródłach, a także w licznych pracach badawczych [25,37,44,54], wskazują, że ekspresja określonych genów HKG nie jest stabilna we wszystkich typach tkanek.
Czynniki wpływające na wybór genu referencyjnego
Aby znaleźć odpowiedni gen referencyjny należy przeanalizować czynniki, które w danej sytuacji mogą wpłynąć na wynik eksperymentu. Dotyczy to również struktury, jak i umiejscowienia genu w genomie. Zwłaszcza w przypadku pracy z materiałem, jakim są tkanki nowotworowe, w których częste są zmiany genetyczne na poziomie chromosomów, wskazane jest sprawdzenie genotypu tkanki. Wykonując taką analizę, można upewnić się, czy wybrany gen referencyjny nie znajduje się w obrębie chromosomu, który ulega delecji, amplifikacji lub innym zmianom mogącym wpływać na liczbę kopii genu w komórce.
Badania przeprowadzone na komórkach nowotworowych okrężnicy udowodniły istnienie różnic w strukturze chromosomów i ekspresji genów [57]. Analiza zmienionych nowotworowo tkanek wykazała, że zwiększenie lub zmniejszenie ilości DNA chromosomalnego, korelowało odpowiednio z nadekspresją lub zmniejszoną ekspresją genów. Zjawisko to zaobserwowano w ponad 60% badanych nowotworów i dotyczyło ono głównie chromosomów: 7, 8q, 13 i 20 (dodatkowe kopie DNA) oraz chromosomów: 1p, 4, 5q, 8p, 14q, 15q, 17p,18 (utrata DNA). Na podstawie prac opisujących te zagadnienia można określić, które miejsca są najbardziej podatne na zmiany w danym typie nowotworu, a zebrane dane mogą posłużyć do wytypowania najwłaściwszego pod tym kątem genu referencyjnego.
Ważnym czynnikiem przy projektowaniu eksperymentu z użyciem metody real-time RT-PCR, jest także prześledzenie budowy genu referencyjnego. Geny eukariotyczne mają strukturę nieciągłą, dlatego trzeba wziąć pod uwagę możliwość alternatywnego ich składania (alternative splicing). Zjawisko to zachodzi np. -glukuronidazy, ubikwityny C [3,10]. Należy zatem uważać na możliwość istnienia w komórce różnych transkryptów tego samego genu i używać starterów o sekwencji obecnej w każdej z możliwych postaci mRNA lub we wszystkich postaciach wykrytych w interesującej badacza tkance.
Pseudogeny definiowane są jako niefunkcjonalne kopie fragmentów genów, włączone do genomu przez retrotranspozycję mRNA lub duplikację genomowego DNA [24]. Ponieważ znaczna część pseudogenów (77%) może być transkrybowana, ilościowe oznaczanie metodą real-time RT-PCR poziomu transkryptów genów mających pseudogeny może prowadzić do błędnych wyników w postaci wyższej niż w rzeczywistości ekspresji analizowanego genu [40]. Jak wykazały badania, niektóre geny metabolizmu podstawowego mają wiele pseudogenów, np. GAPDH ma 52 pseudogeny, cyklofilina A - 63, ACTB - 15 [65]. Aby zwiększyć swoistość w stosunku do stosowanego HKG, stosuje się startery hybrydyzujące do miejsca, w którym wykorzystywany gen referencyjny różni się sekwencją w stosunku do swojego pseudogenu.
Wyszukując odpowiednie geny do procesu normalizacji należy wybierać je tak, by należały one do grup pełniących funkcje inne niż te, w które zaangażowane są geny badane. Ma to na celu uniknięcie możliwej koregulacji genów, co może zaburzać wynik analizy [9,48].
PCR i RT-qPCR: Podstawowe informacje
PCR (polimeryzacja łańcuchów DNA) oraz RT-qPCR (odwrotna transkryptaza i PCR czasu rzeczywistego) to skróty, które kryją w sobie niezwykłe możliwości w dziedzinie biologii molekularnej. Zrozumienie tych technologii jest kluczowe, aby docenić ich potencjał i zastosowanie w różnych dziedzinach nauki. Poznanie mechanizmów działania PCR i RT-qPCR pozwala na bardziej precyzyjne i zaawansowane badania genetyczne, otwierając nowe perspektywy w dziedzinie medycyny, biologii molekularnej oraz nauk biomedycznych.
PCR (Polymerase Chain Reaction)
Skrót oznacza polimeryzację łańcuchów DNA, a technika ta umożliwia wielokrotne kopiowanie konkretnych sekwencji DNA. To jak rewolucja w sposobie, w jaki badamy i rozumiemy genetyczny kod życia. Reakcja łańcuchowa polimerazy (PCR) stanowi stosunkowo prostą i szeroko stosowaną technikę w biologii molekularnej, służącą do wzmacniania i detekcji sekwencji DNA i RNA. W porównaniu z tradycyjnymi metodami klonowania i amplifikacji DNA, które często zajmują kilka dni, PCR potrzebuje zaledwie kilku godzin. Proces PCR to prawdziwy taniec genów. Specjalna polimeraza DNA jest główną gwiazdą, rozdzielając i kopiując łańcuchy DNA podczas cykli podgrzewania i chłodzenia. To jak harmonijny proces, w którym każdy krok ma swoje miejsce, umożliwiając nam szybkie i precyzyjne kopiowanie materiału genetycznego. Proces ten pozwala na wykrywanie, analizę i produkcję dużej ilości kopii określonego fragmentu DNA.
Etapy PCR:
- Denaturacja (Rozpuszczanie): Reakcja PCR rozpoczyna się podgrzewaniem próbki do temperatury około 94-98 stopni Celsjusza. W tym procesie dwuniciowe DNA rozpuszcza się, czyli rozdzielają się dwie nici, co nazywane jest denaturacją.
- Hybrydyzacja (Łączenie): Temperatura reakcji jest następnie obniżana, zazwyczaj do około 50-65 stopni Celsjusza. Na tej temperaturze zaczyna się proces hybrydyzacji, gdzie specjalnie zaprojektowane startery (krótkie sekwencje nukleotydów) łączą się z komplementarnymi sekwencjami na jednej z nici DNA.
- Elongacja (Wydłużanie): Temperatura jest ponownie podnoszona, zazwyczaj do około 72 stopni Celsjusza. W tym etapie aktywowana polimeraza DNA zaczyna syntezować nowy łańcuch DNA, korzystając z jednej z nici DNA jako matrycy.
Powyższe trzy kroki (denaturacja, hybrydyzacja, elongacja) stanowią jedno cykl amplifikacji. Proces ten jest następnie powtarzany kilkakrotnie, co prowadzi do eksponencjalnego wzrostu ilości kopii docelowej sekwencji DNA. Wyniki PCR można następnie analizować, na przykład przy użyciu elektroforezy, sekwencjonowania DNA lub innych metod, w zależności od celu badania.
RT-qPCR (Reverse Transcription Quantitative Polymerase Chain Reaction)
RT (Reverse Transcription): Oznacza odwrotną transkryptazę. Jest to enzym, który przekształca RNA (kwas rybonukleinowy) w komplementarną do niego DNA (kwas deoksyrybonukleinowy), tworząc tzw.
qPCR (Quantitative Polymerase Chain Reaction): Oznacza ilościową reakcję łańcuchową polimerazy. RT-qPCR jest szeroko stosowany w biologii molekularnej do pomiaru ilości mRNA (kwasu rybonukleinowego) w próbkach biologicznych. Odwrotna transkryptaza w czasie rzeczywistym z odwrotną transkrypcją i ilościową reakcją łańcuchową polimerazy (RT-qPCR) to technika używana do analizy ilościowej ekspresji genów. Odwrotna transkryptaza jest enzymem umożliwiającym syntezę jednoniciowego DNA (cDNA) na podstawie matrycy RNA. Ta metoda jest często wykorzystywana do pomiaru ilości mRNA w próbkach biologicznych, umożliwiając naukowcom zrozumienie, jakie geny są aktywowane lub wygaszane w danym warunku. Szybkość PCR w czasie rzeczywistym wynika z możliwości monitorowania ilości amplifikowanego DNA podczas samej reakcji. Dzięki specjalnym fluorochromom lub sondom umieszczonym w reakcji, możliwe jest śledzenie postępu amplifikacji w czasie rzeczywistym. Precyzja tej techniki wynika z możliwości pomiaru ilości DNA na różnych etapach reakcji, co umożliwia dokładne określenie początkowej ilości materiału genetycznego.
Różnice między PCR a RT-qPCR
Teraz, kiedy znamy podstawy, warto zagłębić się w kluczowe różnice między PCR a RT-qPCR. PCR jest jak archiwum genetyczne, operując na istniejącym już DNA. RT-qPCR oferuje większą czułość i precyzję w analizie ilościowej materiału genetycznego. PCR często jest używane w diagnostyce chorób genetycznych, ale RT-qPCR to jak nowa era diagnostyki. PCR (Polymerase Chain Reaction) i RT-qPCR (Reverse Transcription Quantitative Polymerase Chain Reaction) to dwie zaawansowane metody molekularne, które, mimo że mają pewne podobieństwa, znacząco różnią się pod względem zastosowań. PCR jest techniką amplifikacji DNA, umożliwiającą wielokrotne kopiowanie konkretnych fragmentów materiału genetycznego. Z kolei RT-qPCR to połączenie dwóch kluczowych procesów: odwrotnej transkrypcji (RT), która konwertuje RNA na komplementarny do niego fragment DNA, oraz ilościowej reakcji łańcuchowej polimerazy (qPCR), pozwalającej na ilościową analizę skopiowanego DNA w czasie rzeczywistym.
Różnice między PCR a RT-qPCR decydują o ich zastosowaniach. PCR skupia się na amplifikacji DNA, podczas gdy RT-qPCR jest wykorzystywane przede wszystkim do precyzyjnej ilościowej analizy ilości RNA.
Odwrotna transkryptaza (Reverse Transcriptase, RT)
Odwrotna transkryptaza (ang. reverse transcriptase, RT) to enzym, który katalizuje proces odwrotnej transkrypcji, czyli syntezy DNA na matrycy RNA. Jest kluczowym elementem cyklu replikacyjnego retrowirusów, takich jak HIV (wirus zespołu nabytego niedoboru odporności), HTLV (ludzki wirus białaczki z komórek T) czy wirusów zapalenia wątroby typu B (HBV). Mechanizm działania odwrotnej transkryptazy polega na tworzeniu komplementarnej nici DNA (cDNA) na podstawie matrycy RNA. Enzym ten posiada trzy główne aktywności: polimerazową RNA-zależną DNA (tworzy nić DNA na matrycy RNA), polimerazową DNA-zależną DNA (tworzy drugą nić DNA) oraz aktywność RNazy H (degraduje RNA w kompleksie RNA-DNA).
Inhibitory odwrotnej transkryptazy
W kontekście klinicznym, inhibitory odwrotnej transkryptazy stanowią ważną grupę leków przeciwwirusowych stosowanych w terapii zakażeń HIV. Dzielą się na dwie główne klasy: nukleozydowe inhibitory odwrotnej transkryptazy (NRTI), takie jak zydowudyna, lamiwudyna czy tenofowir, oraz nienukleozydowe inhibitory odwrotnej transkryptazy (NNRTI), np. efawirenz, newirapina i rylpiwiryna.
Entekawir
Entekawir, będący nukleozydowym inhibitorem odwrotnej transkryptazy, wykazuje wysoką specyficzność wobec polimerazy HBV, z wartością Ki dla entekawiru-trifosforanu wynoszącą 0,0012 µM. Mechanizm działania polega na konkurencyjnym hamowaniu inicjacji polimerazy, odwrotnej transkrypcji ujemnej nici DNA oraz syntezy nici dodatniej DNA HBV. Entekawir charakteryzuje się długim wewnątrzkomórkowym okresem półtrwania aktywnej formy (15 godzin), co zapewnia trwałe działanie przeciwwirusowe. W badaniach in vitro EC₅₀ dla dzikiego typu HBV wynosi 0,004 µM, natomiast dla szczepów opornych na lamiwudynę (rtL180M, rtM204V) mediana EC₅₀ wynosi 0,026 µM. Entekawir wykazuje również aktywność wobec HIV-1, choć w wyższych stężeniach (EC₅₀ od 0,026 do >10 µM), z możliwością indukcji mutacji M184I w warunkach mikromolowych.
Terapia antyretrowirusowa (ART)
Terapia antyretrowirusowa (ART) stanowi podstawę leczenia zakażenia HIV, umożliwiając skuteczną kontrolę wiremii i zapobiegając progresji do AIDS. Wczesne wdrożenie ART, niezależnie od liczby limfocytów CD4, jest kluczowe dla optymalnych wyników klinicznych oraz ograniczenia transmisji wirusa. Standardowo stosuje się wysoce aktywną terapię antyretrowirusową (HAART), obejmującą co najmniej trzy leki z różnych klas: nukleozydowe i nienukleozydowe inhibitory odwrotnej transkryptazy (NRTI, NNRTI), inhibitory proteazy (PI), inhibitory integrazy oraz inhibitory wejścia. Celem leczenia jest osiągnięcie i utrzymanie niewykrywalnego poziomu wiremii.
tags: #hodowla #odwrocona #reverse #definicja
