Chromatografia: Technika Rozdziału i Analizy Mieszanin
- Szczegóły
Chromatografia jest techniką analityczną i preparatywną, która umożliwia rozdział mieszaniny na poszczególne składniki lub frakcje. Stanowi ona również jedną z metod wyodrębniania czystych postaci poszczególnych składników mieszanin złożonych.
Podstawy Chromatografii
Wykorzystuje ona różnice w zachowaniu się poszczególnych związków w układzie dwufazowym, w którym:
- jedna z faz nie zmienia swojego położenia (faza stacjonarna),
- druga natomiast porusza się względem pierwszej w określonym kierunku (roztwór rozwijający).
Elementy Układu Chromatograficznego
Podstawowe elementy układu chromatograficznego to:
- Faza stacjonarna (sorbent): Czyli stałe lub żelowe złoże, które może oddziaływać międzycząsteczkowo ze związkami tworzącymi analizowaną mieszaninę.
- Faza ruchoma (eluent): Czyli czynnik wymywający, który w przypadku chromatografii cieczowej jest ciekłym rozpuszczalnikiem przenoszącym analizowaną substancję przez złoże.
Dobry eluent powinien zapewniać wystarczającą selektywność układu chromatograficznego, a przy tym nie reagować ani z fazą stacjonarną, ani z substancjami rozdzielanymi (wyłączając zamierzone działania).
Proces Chromatograficzny
Proces chromatograficzny to wielokrotna sorpcja i desorpcja substancji z fazy stacjonarnej do fazy ruchomej i odwrotnie, tzn. z fazy ruchomej do stacjonarnej. Różne związki oddziałują z każdą z faz w charakterystyczny dla siebie sposób i z tego względu przemieszczają się z różną szybkością, co umożliwia ich rozdział. Proces wymywania składników nazywa się elucją.
Przeczytaj także: Jak działa procedura odwrócona?
Rodzaje Elucji
- Gradientowa: W której dzięki zmianie składu fazy ruchomej następuje wzrost siły elucyjnej (np. skład eluentu w trakcie rozdzielania zmienia się od 10% do 90% metanolu w wodzie).
Elucja gradientowa rozwiązuje ten problem dzięki systematycznemu zwiększaniu siły elucyjnej i stanowi najskuteczniejszy sposób rozwiązania tzw. ogólnego problemu elucji.
Chromatogram
Wyniki przeprowadzonej analizy przedstawia się zazwyczaj w postaci chromatogramu, czyli wykresu pików odpowiadających poszczególnym składnikom.
Chromatografia cieczowa pozwala na identyfikację badanych związków.
Analiza Wyników
- Jakościowa: Liczba pików może oznaczać ilość substancji zawartych w badanej mieszaninie, natomiast ich lokalizacja na chromatogramie pozwala określić rodzaj.
- Ilościowa: Wielkość rejestrowanego sygnału detektora.
Rodzaje Chromatografii
Ze względu na ilość pozyskiwanych substancji wyróżnia się chromatografię preparatywną (dostarczającą niewielkich ilości substancji i jedynie sporadycznie) oraz chromatografię procesową lub inaczej produkcyjną (gdy ilość pozyskiwanego produktu jest znacznie większa, a proces prowadzony jest w sposób cykliczny lub ciągły). Obie znalazły zastosowanie m.in.
W odróżnieniu od warunków analitycznych, w warunkach chromatografii preparatywnej dąży się do maksymalnego wykorzystania tzw.
Przeczytaj także: Korzyści z nanofiltracji w mleczarstwie
Układy Faz
- Układ faz normalnych (NP): Wykorzystujący interakcje pomiędzy polarnymi grupami funkcyjnymi rozdzielanych składników, a polarnymi centrami aktywnymi znajdującymi się na powierzchni fazy stacjonarnej. Od pierwszych lat stosowania chromatografii cieczowej, fazą stacjonarną były substancje nieorganiczne, takie jak krzemian magnezu, węglan magnezu, tlenek magnezu lub też węglan wapnia i inne. Fazę ruchomą stanowiły natomiast rozpuszczalniki organiczne. Chromatografię w układzie faz normalnych stosuje się jako alternatywę dla układów faz odwróconych podczas rozdzielania związków niejonowych i raczej nisko oraz średnio polarnych, które nie mogą ulec rozpuszczeniu w środowisku wodnym.
- Układy faz odwróconych (RP): Czyli takie, w których faza stacjonarna jest mniej polarna niż faza ruchoma. Nazwa ich wynika jedynie z historii chromatografii. Fazę ruchomą stanowi tu mieszanina wody i rozpuszczalnika organicznego. Retencja związku zależy od chemicznej natury cząsteczek substancji, eluentu i sorbentu. Substancje opuszczają kolumnę w kolejności od najbardziej polarnych do niepolarnych, a w szeregach homologicznych od nisko- do wysokocząsteczkowych.
Zgodnie z prawem podziału Nernsta, stosunek stężeń w obu fazach w stanie równowagi jest wielkością stałą i charakterystyczną w danych warunkach dla danej substancji. Oznacza to, że jeżeli stężenie badanego składnika w fazie ruchomej jest zbyt duże, substancja ta przechodzi do fazy ciekłej stacjonarnej i odwrotnie, gdy faza ruchoma ma mniejsze stężenie, składnik częściowo przechodzi z fazy stacjonarnej do fazy ruchomej.
Chromatografia Wykluczenia
Ten typ chromatografii eliminuje, o ile to możliwe, zjawisko sorpcji. Składniki mieszaniny rozdzielane są na tzw. sitach molekularnych, czyli ziarnach tworzących pory międzyziarnowe przez które płynie ciecz. Zawierają one również mikropory wewnętrzne, w których przestrzeni eluent praktycznie nie płynie.
Chromatografia Jonowymienna
Ten typ chromatografii korzysta z różnic w ładunku wypadkowym odmiennych cząstek, a rozdział mieszaniny następuje w wyniku odwracalnej wymiany jonów z fazą stacjonarną. Białka naładowane ujemnie (anionowe) można rozdzielać chromatograficznie na kolumnach wypełnionych dodatnio naładowaną dietyloaminoetylocelulozą (DEAE-celulozą).
Do tej grupy chromatografii zalicza się również tzw. technikę wykluczania jonowego, w której mechanizm rozdzielania wykorzystuje zjawisko powstawania tzw.
Chromatografia Par Jonowych
Alternatywą dla chromatografii jonowymiennej jest chromatografia par jonowych, stosowana głównie w układach faz odwróconych, gdy jonowe, albo bardzo silnie polarne fragmenty cząsteczek substancji rozdzielanych są maskowane odpowiednim organicznym przeciwjonem.
Przeczytaj także: Ultrafiltracja i Nanofiltracja – co wybrać?
Chromatografia Powinowactwa
Technika ta wykorzystuje duże powinowactwo wielu białek do specyficznych grup chemicznych (np. oddziaływanie enzym - koenzym) albo innego typu oddziaływania zachodzące pomiędzy fazą stacjonarną, a rozdzielanymi składnikami (np. tzw.).
Można ją stosować bez kolumny, tzn.
Składniki mieszaniny przemieszczają się ku dołowi z szybkością zależną od siły oddziaływań ich cząsteczek z adsorbentem.
Chromatografia Cienkowarstwowa (TLC)
Zalicza się tutaj chromatografię bibułową, w której rozdział substancji wykonuje się na odpowiednio dobranej bibule oraz cienkowarstwową (z ang. Thin Layer Chromatgraphy, TLC), w której sorbent jest osadzony na podłożu, tzn.
Chromatografię cienkowarstwową po raz pierwszy wykorzystano w 1938 roku do oznaczania zanieczyszczeń leków. Jej znaczny rozwój nastąpił po 1956 roku, dzięki odkryciu tzw. urządzenia Stahla, umożliwiającego w prosty sposób przygotowanie warstw chromatograficznych na płytkach szklanych.
Zalety TLC
Główną zaletą TLC jest możliwość przechowywania płytek z rozdzielonymi substancjami. Pozwala ona również określić stopień rozdzielenia substancji na każdym etapie rozwijania chromatografu, a co za tym idzie przerwać ten proces w dowolnym momencie.
Znaczącym ulepszeniem okazało się zastosowanie tzw. densytometrów, czyli detektorów służących do automatycznego dozowania próbki oraz komputerowego opracowywania wyników.
tags: #wykluczenie #donnana #nanofiltracja #mechanizm
