Spektrometria Masowa MALDI-TOF: Zasada Działania i Zastosowania
- Szczegóły
Spektrometria mas MALDI-TOF (Matrix-Assisted Laser Desorption/Ionization Time-Of-Flight) to zaawansowana technika analityczna stosowana w diagnostyce mikrobiologicznej, umożliwiająca szybką i dokładną identyfikację mikroorganizmów na podstawie ich unikalnych profili białkowych.
Zasada działania techniki MALDI
Metoda wykorzystuje jonizację laserem próbki zmieszanej z matrycą absorbującą energię lasera, a następnie analizę czasu przelotu powstałych jonów w polu elektrycznym. Analit (związek badany) jest współkrystalizowany z molowym nadmiarem związków matrycy, zazwyczaj słabe kwasy organiczne absorbujące promieniowanie UV. Następnie promieniowanie laserowe powoduje odparowanie tak otrzymanej mieszaniny analitu i związków matrycy.
Matryca odgrywa kluczową rolę, gdyż silnie absorbuje energię światła laserowego i przyczynia się pośrednio do desorpcji analitu. Poza tym matryca służy jako donor protonów oraz jonów sodu i potasu w mechanizmie jonizacji. Impuls laserowy po dotarciu do materiału matrycy, która zawiera badaną próbkę wywołuje zjawisko desorpcji i jonizacji, w wyniku czego powstają duże dodatnio naładowane jony, które oddalają się w kierunku detektora masowego.
Technika MALDI oferuje niedestuktywne odparowywanie (desorpcję) i jonizację zarówno małych, jak i dużych biomolekuł. Matryca umożliwia badanie substancji nielotnych, wielkocząsteczkowych oraz polarnych. Zasadniczymi cechami związków matrycy stosowanych w technice MALDI jest dobra absorpcja promieniowania z zakresu UV, łatwa sublimacja oraz możliwość dostarczenia po desorpcji dużych ilości protonów potrzebnych do jonizacji badanej substancji.
Najczęściej stosowanymi związkami matrycy są kwasy 3,5-dimetoksy-4-hydroksycynamonowy (SIN), 2,5-dihydroksybenzoesowy (DHB), alfa-cyjano-4-hydroksycynamonowy (α-CN) oraz 1,8,9-trihydroksyantracen (Dithranol).
Przeczytaj także: Wszystko o prostownicy z laserową jonizacją
Rodzaje generowanych jonów
Podczas jonizacji metodą MALDI mogą powstawać jony dodatnie i ujemne (peptydy polikwasowe). W przypadku próbek biologicznych powstają w różnej proporcji jony typu [M+H]+, [M+Na]+ oraz [M+K]+. Natomiast polimery generują przede wszystkim jony stabilizowane kationami metali (przeważnie sodu).
Najczęściej w widmie obserwuje się przede wszystkim intensywny pik molekularny typu [M+H]+ oraz niewielką liczbę jonów wielokrotnie naładowanych typu [M+nH]n+ oraz jonów typu [nM+H]+. Dwa ostatnie typy jonów powstają częściej przy jonizacji peptydów, oraz cząsteczek o dużej powierzchni. MALDI zalicza się do łagodnych sposobów jonizacji, pokrewnych jonizacji chemicznej. Matryca separuje od siebie cząsteczki badanej substancji i w łagodny sposób (tj. bez wywoływania rozkładu) przekazuje im zaabsorbowaną przez siebie energię.
Pomiar masy cząsteczkowej
Pomiar masy cząsteczkowej analizowanego związku odbywa się w spektrometrze masowym (MS). Detektor ten został zmodyfikowany i w technice MALDI mierzy czas przelotu jonów Tof (ang. time of flight) Analizowana substancja rozpuszczona w lotnym rozpuszczalniku miesza się z roztworem matrycy I WSPÓŁKRYSTALIZUJE. Po dokładnym wysuszeniu próbkę wprowadza się do komory pomiarowej aparatu i usuwa powietrze. Po uzyskaniu dostatecznej próżni wykonuje się właściwy pomiar.
Ostatecznym rezultatem analizy MALDI-ToF-MS jest otrzymanie widma spektrometrycznego, na którym widoczne są sygnały od mas powstałych jonów oraz cząsteczki niezjonizowanej [M]. Sygnał cząsteczki niezjonizowanej widoczny jest bardzo rzadko. Sygnały układają się zgodnie ze wzrostem masy otrzymanego jonu bądź molekuły. Ich intensywność zależy od proporcji i rodzaju otrzymanych jonów.
Zastosowanie MALDI-TOF w mikrobiologii klinicznej
W praktyce klinicznej MALDI-TOF znacząco skraca czas identyfikacji patogenów z 24-48 godzin (metody tradycyjne) do zaledwie kilkunastu minut, co przekłada się na szybsze wdrożenie celowanej terapii. Technika ta charakteryzuje się wysoką czułością i specyficznością, umożliwiając identyfikację szerokiego spektrum bakterii, grzybów i drożdży, nawet na poziomie szczepów. Spektrometria MALDI-TOF rewolucjonizuje diagnostykę mikrobiologiczną poprzez redukcję kosztów, minimalizację zużycia odczynników oraz znaczne skrócenie czasu oczekiwania na wyniki.
Przeczytaj także: Zasada Działania Drukarki Laserowej
Spektrometr masowy typu MALDI-TOF tworzy widma unikatowego profilu białkowego badanego mikroorganizmu (białka rybosomalne), tzw. molekularny „odcisk palca”, który jest następnie porównywany z referencyjną bazą danych. Dzięki tej technice uzyskujemy szybką i dokładną klasyfikację taksonomiczną nieznanych organizmów na poziomie rodzaju lub gatunku, w próbce badanej. Na wyniki analizy bakterii czeka się zaledwie klika minut, co w porównaniu z 24-48 godzinnym czasem potrzebnym do identyfikacji drobnoustrojów metodami biochemicznymi jest dużą oszczędnością czasu. Ma to ogromne znaczenie szczególnie w przypadku próbek klinicznych.
Obecnie, po zdiagnozowaniu u pacjenta sepsy wykonuje się posiew krwi. Jeśli wynik jest dodatni laboratorium wykonuje bakterioskopię, która trwa ok. 1 godziny. Po tym czasie diagności posiadają częściowy wynik dzięki któremu, wiedzą czy mają do czynienia z bakteriami gram-dodatnimi, gram-ujemnymi czy grzybem drożdżopodobnym. Następnym etapem jest izolacja kolonii, która w przypadku bakterii trwa ok. 24 godziny, natomiast w przypadku grzybów ok. 5 dni. Ostateczna identyfikacja i testy wrażliwości na środki przeciwdrobnoustrojowe zajmują od 24 do 48 dodatkowych godzin. Dopiero po tym okresie publikowany jest raport laboratoryjny i dostosowywana najskuteczniejsza terapia. W tym czasie stan pacjenta pogarsza się z godziny na godzinę. Skrócenie czasu diagnostyki patogenu może uratować życie pacjenta, a także zaoszczędzić sporo czasu służby medycznej, a tym samym pieniędzy szpitala.
Jak zostało wspomniane MALDI-TOF identyfikuje organizmy na podstawie ich unikatowego profilu białkowego. W tym celu mikroorganizmy muszą być wyizolowane z podłoży hodowlanych/ mediów hodowlanych. To zajmuje dodatkowy czas dlatego wielu naukowców zaczęło pracować nad specjalnymi protokołami, które ostatecznie pozwoliły na identyfikację drobnoustrojów bezpośrednio z dodatnich posiewów krwi i moczu.
Przykłady zastosowań MALDI-TOF
- Zespół Ferreira uzyskał dokładną identyfikację 83,3% bakterii gram-ujemnych i 31,8% bakterii gram-dodatnich w porównaniu z metodami tradycyjnymi.
- Zespół Moussaoui za pomocą spektrometru masowego typu MALDI-TOF uzyskał aż 91,1% dokładnych identyfikacji bakterii gram-ujemnych i 89% gram-dodatnich.
- Badania prowadzone przez zespół Kohlmann wykazały, że już po 4 godzinach wstępnej hodowli MALDI-TOF jest cennym narzędziem do szybkiej identyfikacji patogenu z dodatnich posiewów krwi, umożliwiając łatwe włączenie do rutynowej diagnostyki i dające możliwość znacznie wcześniejszego dostosowania leczenia.
- Wspomniany wyżej zespół Ferreira wykazał także 93,1% zgodność między identyfikacją bakterii bezpośrednio z próbek moczu metodą MALDI-TOF, a metodami tradycyjnymi.
- Badania Nagy i jej zespołu wykazały, że MALDI-TOF prawidłowo zidentyfikował 86,2% losowo wybranych klinicznych izolatów beztlenowych (badania na 283 izolatach).
- Badania prowadzone w Hiszpanii przez zespół Mediavilla-Gradolph na izolatach pobranych głównie z górnych dróg oddechowych wykazały, że MALDI-TOF jest dokładnym, szybkim i opłacalnym systemem identyfikacji gatunków prątków. Identyfikacja metodą MALDI-TOF była prawidłowa w 98,4% (65/66 izolatów) prątków niegruźliczych izolowanych w praktyce klinicznej (M. avium, M. intracellulare, M. abscessus, M. chelonae, M. fortuitum, M. mucogenicum , M. kansasii i M. scrofulaceum).
- W badaniach przeprowadzonych przez zespół Harrisa oceniono zdolność MALDI-TOF w połączeniu z oprogramowaniem MALDI Biotyper do identyfikacji 158 scharakteryzowanych izolatów gronkowców z zakażeń protetycznych stawów, w tym 36 Staphylococcus aureus, 100 Staphylococcus epidermidis, 10 Staphylococcus capitis, 8 Staphylococcus lugdunensis, 2 Staphylococcus warneri i 2 Staphylococcus haemolyticus. Sugerowana identyfikacja gatunku za pomocą bazy MALDI Biotyper była poprawna dla wszystkich izolatów, wskazując na wiarygodne różnicowanie między S.
- Badania zespołu Bille wykazały, że 96,3% drożdży i 92,2% Aspergillus spp. zidentyfikowano po pojedynczym pasażowaniu. Po drugim pasażowaniu ogólny wskaźnik identyfikacji wyniósł 98,8% dla drożdży (160/162) i 98,4% (63/64) dla Aspergillus spp.
- Zespół Steina porównał identyfikację pleśni wykorzystując do tego trzy bazy: bibliotekę Brukera, bibliotekę National Institutes of Health (NIH) oraz internetową bibliotekę Mass Spectrometry Identification (MSI) z tradycyjnymi i molekularnymi metodami identyfikacji. Wyniki otrzymane ze wszystkich 3 bibliotek miały większą dokładność w identyfikacji na poziomie rodzaju (≥94,9%) niż metody konwencjonalne (86,4%). W ramach tego projektu zidentyfikowano 73,3% izolatów na poziomie gatunkowym przy użyciu MALDI-TOF w porównaniu do zaledwie 31,7% metodami konwencjonalnymi.
- Również badania prowadzone we współpracy Jagiellońskiego Centrum Innowacji z Uniwersyteckim Szpitalem Dziecięcym w Krakowie potwierdzają niezwykłą skuteczność tej metody.
Przyszłość MALDI-TOF
Myśląc o coraz szerszym zastosowaniu spektrometru masowego typu MALDI-TOF naukowcy rozpoczęli prace nad jego wykorzystywaniem w typowaniu drobnoustrojów i testowaniu wrażliwości na środki przeciwdrobnoustrojowe. Przykładem mogą być badania prowadzone przez dwa zespoły Edwards-Jones’a oraz Du. Opisali oni różne profile widmowe dzięki którym można rozróżnić gatunki Staphylococcus wrażliwe od tych, które są oporne na metycylinę. Jednak by badania te miały większe znaczenie to w przyszłości należałoby je rozszerzyć na inne izolaty kliniczne, a także na inne leki. Równie obiecujące wydają się być wyniki badań Murray’a. Naukowiec wskazał, że widma masowe są powtarzalne i rozróżniające dla typowania oraz, że otrzymane wyniki są porównywalne z konwencjonalnymi tj. tradycyjnymi metodami typowania.
Podsumowanie
Jak pokazują wszystkie powyższe badania oraz szereg innych, spektrometr masowy typu MALDI-TOF doskonale sprawdza się w diagnostyce klinicznej. Metoda ta pozwala zaoszczędzić czas, pracę służby zdrowia, a także pieniądze. Jest korzystna zarówno z perspektywy pacjenta jak i ośrodka medycznego. Jedynym czynnikiem blokującym korzystanie ze spektrometru masowego typu MALDI-TOF jest koszt jego zakupu. Rozwiązaniem tego problemu może być nawiązanie współpracy z laboratorium, który taki sprzęt już posiada. Jedną z takich firm jest Jagiellońskie Centrum Innowacji, które od lat współpracuje między innymi z Uniwersyteckim Szpitalem Dziecięcym w Krakowie oraz Centrum Badań Mikrobiologicznych i Autoszczepionek.
Przeczytaj także: Wykorzystanie jonizacji przez elektrorozpraszanie
tags: #spektrometria #masowa #MALDI #TOF #zasada #działania
