Jonizacja przez elektrorozpraszanie z desorpcją krwi: Wykorzystanie w proteomice i diagnostyce klinicznej
- Szczegóły
Pojęcie proteomiki, czyli analizy proteomu wprowadzono w połowie lat 90.XX wieku. Dyscypliną zajmującą się proteomem jest szybko rozwijająca się dziedzina nauki zwana proteomiką. Celem proteomiki jest identyfikacja, a także poznanie struktury, funkcji oraz oddziaływań jakie są zakodowane w genomie białek tworzących proteom.
Badania proteomiczne skupiają się na dwóch obszarach badań. Pierwszy jest związany z ekspresją białek, natomiast drugi z ich wzajemnymi oddziaływaniami. Celem proteomiki ekspresji jest poznanie wzorów ekspresji białka w określonych warunkach, jak również dążenie do ustalenia odpowiedniej mapy całego proteomu.
Analiza profili białkowych osób zdrowych i chorych, których celem jest wykrycie różnic pomiędzy nimi należy do podstawowych zadań proteomiki klinicznej. Naukowcy w przeprowadzanych badaniach przeszukiwania całego proteomu osoby chorej zauważają odchylenia. Należy do nich odmienna ekspresja białek aniżeli w warunkach fizjologicznych. Białka te zostają biomarkerami określonego stanu patologicznego.
Podział technologii proteomicznych można podzielić na techniki stosowane do charakterystyki białek i generowania map białkowych jak również takie, które służą do badań funkcji białek oraz interakcji między nimi. Pierwszą grupę proteomicznych narzędzi stanowi elektroforeza dwuwymiarowa, spektrometria mas oraz techniki, które pozwalają na identyfikację białek takie jak „białkowy odcisk palca”. W badaniach interakcji przede wszystkim stosuje się metody oparte na immunopowinowactwie, a także drożdżowy system dwuhybrydowy. Na współczesną proteomikę składają się badania podstawowe oraz kliniczne.
Znaczenie spektrometrii mas w proteomice klinicznej
W badaniach proteomicznych łączy się metody biochemiczne, fizykochemiczne i bioinformatyczne. W badaniach tym możliwe jest jednoczesne analizowanie tysięcy białek z danego typu komórek lub tkanek. MS jest zdecydowanie konkurencyjna w stosunku do innych metod na ogół stosowanych w proteomice, przede wszystkim z uwagi na możliwość analizy białek będących w bardzo małych stężeniach, a także w skomplikowanych mieszaninach.
Przeczytaj także: Profesjonalna stylizacja włosów w domu
Spektrometria masowa jest techniką analityczną pozwalającą na precyzyjny pomiar stosunku masy do ładunku elektrycznego jonu, gdzie przy znanym ładunku jonu daje możliwość obliczenia masy z dokładnością do pojedynczych atomów. Typowy spektrometr masowy składa się z komory jonizacyjnej, analizatora różnicującego jony pod względem stosunku ich masy do ładunku i detektora zliczającego liczbę jonów, które są sprzężone z komputerowym systemem rejestracji i analizy danych.
Spektrometria masowa znalazła zastosowanie w badaniach budowy strukturalnej cząsteczek, składu chemicznego, czystości danej substancji oraz identyfikacji zanieczyszczeń. Głównymi zaletami spektrometrii masowej są dokładność wyznaczenia masy, rozdzielczość do kilku jednostek masy atomowej oraz szeroki zakres stosowania, od peptydów do dużych białek (>200 kDa). Ponadto MS umożliwia detekcję strukturalnych wariantów białek (białka zmodyfikowane posttranslacyjnie, mutanty).
Znaczenie spektrometrii mas polega na rozdzielaniu w polu elektromagnetycznym ze względu na wartość stosunku masy m do ładunku z (m/z) zjonizowanych cząstek, jakie znajdują się w analizatorze w wysokiej próżni. Zależnie od rodzaju analizowanych substancji, używa się różnych technik jonizacji i rozdziału jonów.
Techniki jonizacji w spektrometrii mas
W MS do analiz białek wykorzystywane są niskorozdzielcze analizatory (kwadrupolowe, pułapki jonowe), bądź wysokorozdzielcze (mierzące czas przelotu jonów, cyklotronowy rezonans jądrowy z transformacją Furiera). Najbardziej rozpowszechnionymi metodami jonizacji są desorpcja laserem w stałej matrycy MALDI (ang. matrix-assisted laser-desorption ionization) oraz elektrorozpylanie (ESI, ang. Electrospray).
Elektrorozpylanie (ESI)
Technika ESI polega na rozpylaniu cieczy, która zawiera badaną substancję, w polu elektrycznym o wysokim napięciu (około 1-5 kV). Na ogół metoda ta nie powoduje fragmentacji badanych cząsteczek. Podczas wykorzystania tej techniki wzbudzania, powstające jony często mają ładunek wielokrotny, natomiast liczba przyłączonych protonów zależna jest od liczby zasadowych aminokwasów jakie występują w badanych cząsteczkach.
Przeczytaj także: Wszystko o prostownicy z laserową jonizacją
Cząsteczka białka ma możliwość przyłączenia kilkunastu, a nawet kilkudziesięciu protonów dlatego można analizować białka o wysokich masach cząsteczkowych, które mogą wynosić kilkaset tysięcy daltonów (Da). Głównymi zaletami tej metody są: wysoka czułość oznaczeń, możliwość analizy dużych cząsteczek do około 80 000 Da, minimalna fragmentacja próbki w czasie jonizacji, a także kompatybilność z technikami chromatograficznymi i elektroforetycznymi.
Dzięki sprzężeniu ESI, a w późniejszym czasie także MALDI, z chromatografią cieczową uzyskano dalsze zwiększenie czułości analiz w MS.
Desorpcja laserowa w stałej matrycy (MALDI)
Inną metodą jonizacji stosowaną w spektrometrach służących do analizy peptydów i białek jest desorbcja laserowa w stałej matrycy - MALDI.W technice tej stosuje się jonizację wiązką laserową o odpowiednio dobranej energii, by nie doprowadzać do fragmentacji cząsteczek, a tylko do ich „wybijania” z właściwie przygotowanej matrycy. Matryca pochłania energię lasera, która z kolei przekazywana jest do analizowanych cząsteczek.
Spektrometry MALDI stosowane są do analizy białek o masach od ~1000 Da do nawet kilkuset tysięcy Da. Technika MALDI polega na kokrystalizacji cząstek substancji badanej z cząsteczkami matrycy absorbującej światło, zwykle kwasów aromatycznych. Zazwyczaj jako matryce wykorzystuje się pochodne kwasu cynamonowego (np. kwas synapinowy, kwas α-cyjano-4-hydroksycynamonowy).
Cząsteczki białka w matrycy wzbudza się za pomocą światła lasera. W wyniku tego z kryształów desorbowane są uprotonowane cząsteczki próbki, a powstałe kationy, mające na ogół pojedynczy ładunek ([M + H]+), które nazywane są jonami molekularnymi. W normalnych warunkach nie obserwuje się ich fragmentacji.
Przeczytaj także: Pyły zawieszone, filtry i jonizacja w oczyszczaczach powietrza
SELDI
W podobny sposób działają spektrometry typu SELDI (ang. surface-enhanced laser desorption ionization). Wykorzystują one desorbcję zjonizowanych światłem laserowym cząsteczek białek następujących z odmiennego typu powierzchni swoiście wiążących białka. Takie powierzchnie są pokryte substancjami będącymi odpowiednikami złóż chromatograficznych. SELDI stosowane są przede wszystkim w proteomice klinicznej w badaniach przesiewowych.
Powszechne zastosowanie proteomiczne mają typy analizatorów m/z - czasu przelotu jonów - ToF (ang. time of flight), które rejestrują czas przelotu zjonizowanych cząsteczek (zazwyczaj 0,01-1 ms) i są odwrotnie proporcjonalne do wartości m/z analizowanych jonów. Z widma masowego można odczytać jaka liczba jonów o precyzyjnie określonej masie została zliczona przez detektor.
Zastosowanie spektrometrii mas w identyfikacji białek
Spektrometria mas wykorzystywana jest także do badań strukturalnych białek, a szczególnie do ich identyfikacji. W tym celu oczyszczone białko początkowo poddaje się trawieniu na mniejsze fragmenty przy pomocy enzymu (zastosowanie znajdują tu proteazy, jak: chymotrypsyna, trypsyna oraz kolagenoza). Uzyskane peptydy wymywa się z żelu, a następnie poddaje analizie.
Na spektrometrze MALDI-TOF otrzymuje się widmo, które ukazuje masy poszczególnych poptydów. Jest to mapa peptydowa, typowa dla każdego białka, co jest skutkiem specyfiki substratowej enzymu. W wyniku trawienia otrzymane masy peptydów są porównywane z masami peptydów wynikającymi z trawienia in silico sekwencji aminokwasowych, które są obecne w białkowych bazach danych. Metoda ta umożliwia jedynie identyfikację poznanych wcześniej białek.
Inna metoda identyfikacji białek i peptydów, tandemowa spektrometria mas z kolizyjnie indukowaną fragmentacją - CID MS/MS, umożliwia ich jednoczesne sekwencjonowanie, za pomocą zastosowania spektrometrów z podwójnym analizatorem. W pierwszym analizatorze selekcjonuje się wybrany jon molekularny bądź fragmentacyjny spośród powstających w czasie procesu wzbudzania jonów. Jon fragmentacyjny poddawany jest w komorze kolizyjnej zderzeniom z atomami wprowadzonego gazu szlachetnego (hel albo argon), co skutkuje rozpadem jonu macierzystego na fragmenty (jony potomne).
W oparciu o masę jonów potomnych jest ustalany skład aminokwasowy danego peptydu, którego jony poddane zostały zderzeniom w komorze kolizyjnej. Prawidłowa analiza kombinatoryczna widma jonów potomnych umożliwia ustalenie sekwencji aminokwasów w łańcuchu peptydowym. Wykorzystanie takiego podejścia daje możliwość identyfikacji nieznanych wcześniej białek. Wysokorozdzielcze spektrometry mas na przykład z analizatorami wykorzystującymi zjawisko cyklotronowego rezonansu jądrowego z transformacją Fouriera - FT-ICR pozwalają na wyznaczenie masy cząsteczkowej z dokładnością 10-4. Daje to możliwość określenia podstawowego składu analizowanego jonu z dużą precyzją.
Aktualnie popularnością cieszą się podejścia metodyczne, w których wykorzystuje się sprzężenie aparatów do chromatografii cieczowej ze spektrometrem mas (LC-MS). W tym przypadku rozdziela się metodami chromatografii cieczowej mieszaniny białek albo peptydów uzyskanych po enzymatycznym trawieniu białek, a kolejnie analizuje się w różnego typu spektrometrach mas. Eluat z kolumny chromatograficznej jest bezpośrednio wprowadzany do komory jonizacyjnej spektrometrów ESI, bądź też frakcje chromatograficzne są zbierane i kokrystalizowane z matrycą na prawidłowych płytkach, a następnie analizowane w spektrometrach MALDI-TOF. Dwuwymiarowa analiza, gdzie pierwszy wymiar stanowi czas retencji na kolumnie chromatograficznej, natomiast drugim wymiarem jest wartość m/z przyczynia się do jednoczesnej detekcji w mieszaninie kilkuset białek.
Podstawowe zadania proteomiki klinicznej
Podstawowym zadaniem proteomiki klinicznej (ang. clinical proteomics) jest odkrywanie różnic w proteomie osób zdrowych oraz chorych, związków pomiędzy stanem proteomu a stanem rozwoju choroby, a także zmian zachodzących w profilach białkowych inicjowanych w odpowiedzi na czynnik terapeutyczny. Takie czynniki nazywane są biomarkerami bądź znacznikami, a ich stan oraz ilość wskazuje na ryzyko choroby, procesy zawansowania choroby, a także efekty odpowiedzi na interwencję terapeutyczną.
Tak więc celem proteomiki klinicznej jest identyfikacja oraz scharakteryzowanie biomarkerów białkowych, które są wykorzystywane w molekularnej diagnostyce choroby. W diagnostyce medycznej przedmiotem badań proteomiki klinicznej, może być tkanka bądź organ docelowy, w którym następuje rozwój choroby, lub tkanka zastępcza. Najczęściej jest to krew albo materiał pochodny (osocze bądź surowica).
We krwi znajdują się komórki oraz produkty ich metabolizmu, zarówno te w których rozwija się proces chorobowy jak i takie które mają styczność z chorym narządem bądź tkanką (np. komórki układu odpornościowego). Dokonując analizy surowicy lub osocza krwi można otrzymać wzór zestawu białek i peptydów, charakterystyczny dla danego osobnika (profil białkowy, widmo masowe). Następnie, stosując metody analizy matematycznej, porównywane są profile charakterystyczne dla osób zdrowych i chorych. Jednocześnie poszukiwane są różnicujące je „piki”. W najlepszym układzie należy zidentyfikować obecność białek w takich różnicujących „pikach”, natomiast zmiany poziomu zidentyfikowanego biomarkera sprawdza się innymi metodami (np. immunologicznymi).
Zastosowanie analizy proteomicznej krwi w diagnostyce chorób nowotworowych
Jednym z możliwych zastosowań analizy proteomu krwi przy użyciu spektrometrii mas jest molekularna diagnostyka nowotworów. Przyczyną, jak również konsekwencją choroby nowotworowej, mogą być zmiany profilu peptydów i białek krwi. Bez względu na to powinny one przedstawiać patologiczny stan narządu oraz całego organizmu, co umożliwa diagnostykę choroby. Obecnie poszukuje się zestawu znaczników, w których każdy składnik osobno posiada niewielką przydatność diagnostyczną, lecz jako kompletny zestaw mają wysoką swoistość i czułość.
Panel markerów, mający kilka bądź kilkadziesiąt składowych, nazywany jest klasyfikatorem. Posiadają one poziomy ekspresji wybranych genów wyselekcjonowane za pomocą metod funkcjonalnej genomiki. Zakłada się, że analiza wieloskładnikowych zestawów białek oraz peptydów wybranych ze złożonych profili proteomicznych surowicy krwi będzie posiadać znaczenie w praktykach klinicznych.
Analiza proteomu tkanki docelowej jest o wiele wiarygodniejszym źródłem informacji o chorobie nowotworowej aniżeli badanie tkanki zastępczej. Jednakże w badaniach przesiewowych, wczesnego wykrywania choroby w stadium „przedklinicznym", wykrywania mikroprzerzutów bądź diagnostyki nowotworów leczonych bez zastosowania chirurgii, analiza proteomu krwi jest niezbędną metodą diagnostyczną.
Techniki LDI sprzężone ze spektrometrią mas
Techniki LDI sprzężone ze spektrometrią mas z powodzeniem znajdują zastosowanie w badaniu budowy i występowania syntetycznych związków chemicznych i molekuł wchodzących w skład złożonych układów biologicznych tj. tkanki, krew, osocze, mocz.
MALDI (Laserowa desorpcja/jonizacja wspomagana matrycą)
MALDI (ang. Laserowa desorpcja/jonizacja wspomagana matrycą jest najbardziej znaną i najczęściej stosowaną metodą do badania nielotnych, wielkocząsteczkowych, delikatnych cząsteczek biologicznych. Została ona opracowana pod koniec lat 80 z myślą o śledzeniu zawartości białek, peptydów, węglowodorów i nici DNA. Klasyczna procedura MALDI rozpoczyna się od powlekania analitu roztworem matrycy. Po odparowaniu rozpuszczalnika i współkrystalizacji matrycy i analitu gotową do pomiaru próbkę umieszcza się we wnętrzu spektrometru i poddaje się ją krótkim impulsom lasera.
SALDI (Surface Assisted Laser Desorption/Ionization)
W roku 1995 Sunner i Chen rozwinęli badania nad nieorganicznymi matrycami do analiz metodą LDI. Nanomateriałami określa się regularne struktury złożone z jednostek nie przekraczających 100 nm. Posiadają one szereg właściwości, które pozwoliły na sprzężenie z LDI.
DIOS (Desorption/Ionization on Silicon)
Technika ta jest jedną z najczęściej stosowanych metod w identyfikacji peptydów, węglowodorów, kwasów i soli organicznych, związków metaloorganicznych. Stała się także ważnym narzędziem w wykrywaniu nielegalnych narkotyków. Porowate płytki krzemowe uzyskuje się na drodze elektrochemicznego wytrawiania krystalicznego krzemu w alkoholowym roztworze kwasu fluorowodorowego.
MSI (Mass Spectrometry Imaging) - Obrazowanie tkanek zwierzęcych przy pomocy spektrometrii mas
Istotą obrazowania jest wizualizacja rozkładu przestrzennego związków pochodzenia biologicznego i syntetycznego w badanym materiale biologicznym. Zestaw danych otrzymany metodą MSI jest wynikiem powiązanych ze sobą składowych, wśród których wyróżniamy: położenie punktu na powierzchni (x,y), stosunek masy do ładunku (m/z) oraz intensywność (I).
tags: #jonizacja #przez #elektrorozpraszanie #z #desorpcją #krwi
