Modyfikacje potranslacyjne białek: Fosforylacja i glikozylacja seryny/treoniny
- Szczegóły
Modyfikacje potranslacyjne (PTM) - takie jak fosforylacja, glikozylacja czy ubikwitynacja - mogą być identyfikowane i lokalizowane za pomocą spektrometrii mas.
Modyfikacje potranslacyjne seryny i treoniny
Modyfikacje potranslacyjne seryny i treoniny (PTM) odnoszą się do modyfikacji chemicznych, którym ulegają białka po syntezie, przy czym najpowszechniejszymi formami modyfikacji są fosforylacja i glikozylacja.
PTM na resztach seryny i treoniny obejmują głównie fosforylację i O-glikozylację. Po modyfikacji te reszty aminokwasowe mogą znacząco zmienić aktywność, stabilność i możliwości interakcji białka, odgrywając w ten sposób kluczową rolę w przekazywaniu sygnalizacji komórkowej, regulacji metabolicznej i innych kluczowych procesach biologicznych.
Dogłębne badania tych modyfikacji pomagają odkryć mechanizmy molekularne stojące za czynnościami życiowymi i mogą zapewnić nowe cele w leczeniu chorób. Dlatego seryna i treonina PTM mają niezastąpione znaczenie zarówno w podstawowych badaniach biologicznych, jak i zastosowaniach klinicznych.
Chomix posiada zaawansowaną technologię spektrometrii mas, zdolną do bezpośredniej i precyzyjnej analizy różnego rodzaju modyfikacji potranslacyjnych białek i ich specyficznych miejsc.
Przeczytaj także: Modyfikacje Ursusa C-360 - wydech i filtr
Dzięki sprytnemu połączeniu technik wzbogacania separacji i znakowania izotopowego można przeprowadzić wielkoskalowe, wysokowydajne analizy jakościowe i ilościowe różnych modyfikacji, zapewniając solidne wsparcie techniczne dla dogłębnych badań nad modyfikacjami potranslacyjnymi białek.
O-glikozylacja
O-glikozylacja to proces biochemiczny, który przenosi łańcuchy cukrowe na atomy tlenu reszt seryny i treoniny w łańcuchach peptydowych. Stosując odczynniki UDP-GalNAz i Y289L GalT1, środki te mogą znakować cząsteczki cukru w miejscach glikozylacji grupą -N3.
Kolejne etapy obejmujące chemię kliknięć, trawienie enzymatyczne, wzbogacanie i spektrometrię mas o wysokiej rozdzielczości pozwalają na precyzyjną identyfikację miejsc O-glikozylacji, ujawniając w ten sposób kluczową rolę tej modyfikacji potranslacyjnej w organizmach.
Zalety analizy modyfikacji potranslacyjnych
- Profesjonalna wiedza: Dzięki bogatemu doświadczeniu i publikacjom w wiodących czasopismach oferujemy usługi dostosowane do indywidualnych potrzeb w celu uzyskania optymalnych wyników.
- Rygorystyczne zarządzanie jakością: Nasze dojrzałe systemy jakości są zgodne z normami ISO9001, zapewniając wiarygodne raporty.
- Kompleksowa obsługa: od projektu sondy po analizę bioinformatyczną - zapewniamy kompleksowe konsultacje po dostawę, wraz z aktualnymi aktualizacjami postępów.
- Zaawansowany sprzęt: Wyposażony w najnowocześniejsze spektrometry mas, takie jak Thermo Fisher Orbitrap Exploris 480 i Bruker timsTOF, wspieramy przełomowe badania.
Usługi analizy modyfikacji potranslacyjnych
Nasz serwis Projekt Modyfikacje potranslacyjne seryny/treoniny w oparciu o spektrometrię mas o wysokiej rozdzielczości:
- Próbka: Lizat, żywe komórki, próbki tkanek
- Platforma sprzętowa: VanquishNeo UPLC w połączeniu ze spektrometrem mas Orbitrap Exploris 480 (Thermo Fisher Scientific); EASY-nLC1200 UPLC w połączeniu ze spektrometrem mas Q Exactive HF-X (Thermo Fisher Scientific)
- Czas trwania projektu: 4-8 tygodni
- Elementy dostarczane: Raport z projektu (w tym obrazy żelowe, informacje o witrynie itp.)
- Cena: Kliknij, aby skonsultować się
Studium przypadku: Analiza O-GlcNAcylacji
Cel projektu: Celem tego projektu jest przeprowadzenie dogłębnej analizy chemicznej proteomiki modyfikacji potranslacyjnej O-GlcNAcylacji z wykorzystaniem technologii spektrometrii mas.
Przeczytaj także: Zalety modyfikacji obudowy filtra powietrza
Rozwiązanie: Stosujemy połączone podejście do znakowania metabolicznego i spektrometrii mas, aby przeprowadzić precyzyjną i wszechstronną analizę jakościową miejsc O-glikozylacji.
W procesie eksperymentalnym najpierw określamy ilość enzymu Y289L GalT1 przy użyciu technologii żelu fluorescencyjnego, a następnie przeprowadzamy analizę spektrometrii mas w rygorystycznie określonych warunkach eksperymentalnych. W dwóch rundach powtarzanych eksperymentów zidentyfikowano w sumie 36 wiarygodnych miejsc glikozylacji. Zaprezentowano przykład typowego widma MS2.
Rodzaje modyfikacji potranslacyjnych
Białka powstające w trakcie translacji - by mogły pełnić swoje funkcje w komórce - często wymagają dodatkowych zmian. Możliwości modyfikacji jest wiele - ogólnie dzieli się je na dwa rodzaje:
- Nieodwracalne modyfikacje białek
- Odwracalne modyfikacje białek
Przykłady obróbki potranslacyjnej białek:
- Usunięcie metioniny z N‑końca peptydu
- Częściowa proteoliza
- Poliubikwitynacja
- Przyłączenie kotwicy GPI
- Fosforylacja i defosforylacja
- Acetylacja, deactylacja, metylacja i demetylacja
- Ubikwitynacja i deubikwitynacja
- Glikozylacja
W zależności od miejsca przyłączenia cząsteczki cukrowej wyróżnia się N‑glikozylację (wiązanie tworzy się z udziałem atomu azotu w aminokwasie) oraz O‑glikozylację (wiązanie glikozydowe tworzone jest poprzez grupę hydroksylową aminokwasu, najczęściej seryny lub treoniny). Glikozylacja może zachodzić równolegle z translacją (N‑glikozylacja). Procesem ściśle potranslacyjnym jest O‑glikozylacja w aparacie Golgiego.
Analiza modyfikacji potranslacyjnych za pomocą spektrometrii mas
Przebieg analizy jest podobny do standardowej identyfikacji białek: białka są trawione do peptydów, rozdzielane za pomocą HPLC i analizowane metodą MS. Jednak analiza PTM jest bardziej złożona. Należy wykryć konkretny zmodyfikowany peptyd, a nie dowolny fragment, a wydajność jonizacji peptydów zależy od ich sekwencji - co oznacza, że nie wszystkie peptydy są zawsze obserwowane.
Przeczytaj także: Filtracja a stężenie białek i mocznika - studium przypadku
Oczyszczanie i charakterystyka kompleksów białek roślinnych
Ogólnym celem tej procedury jest identyfikacja potranslacyjnych modyfikacji białek zaangażowanych w kompleksy białek roślinnych, najpierw przejściowo lub stabilnie wyrażanych w planie, białku będącym przedmiotem zainteresowania. Następnie wyekstrahuj wszystkie białka z tkanki rośliny i wytrącić białko będące przedmiotem zainteresowania. Następnie oddziel białka wytrącone immunologicznie na żelu akrylowym, a następnie wyekstrahuj i strawij białka z interesującego nas pasma żelu.
Teraz prześlij próbki białek do spektrometrii mas. Ostatecznie wyniki spektrometrii mas mogą wykryć dynamiczne zmiany w modyfikacjach potranslacyjnych, takich jak fosforylacja.
W przeciwieństwie do metod alternatywnych, takich jak inkubacja kinazy in vitro z substratem, ta metoda powoduje ekspresję białek w sadzarce. Nie musisz więc wiedzieć, która kinaza jest odpowiedzialna za fosforylację. Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie biologii roślin, takie jak sposób transdukowania sygnałów w odpowiedzi na stres, zmiany środowiskowe lub rozpoznawanie patogenów.
Oprócz identyfikacji fosforylacji, miejsc aktywowanych kompleksów białkowych oporności, metoda ta może być szeroko stosowana do dowolnej modyfikacji potranslacyjnej dowolnego kompleksu białek roślinnych.
Procedura oczyszczania i analizy
- W celu uzyskania przejściowej ekspresji należy wyhodować szczepy tohin agrobacterium do fazy stacjonarnej. Zbierz agrobakterie przez odwirowanie w temperaturze 3000 g przez pięć minut. Ponownie zawiesić granulki i bufor infiltracji.
- Czterotygodniowe rośliny hamana NCOA z agrobakteriami ręcznie za pomocą jednomililitrowej strzykawki bezigłowej lub próżniowo z 0,02% środkiem powierzchniowo czynnym, dwa do pięciu dni po infiltracji.
- Następnie miele 20 gramów tkanki roślinnej i ciekłego azotu za pomocą moździerza i tłuczka w 80 mililitrach zimnego buforu C do 20 gramów. Dobrze wymieszaj i rozmroź na lodzie.
- Przefiltrować homogenat i odwirować w temperaturze 30 000 G przez 30 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza.
- Następnie należy pobrać porcję niezwiązanego ekstraktu na plamę immunologiczną.
- Zawiesić roztwór gnojowicy za pomocą końcówki o szerokim otworze.
- Pulsować trzy razy przez pięć sekund za pomocą wirówki stołowej w celu wytrącenia matrycy powinowactwa i usunąć supernat po trzech do pięciu przemyciach jednym mililitrem zimnego buforu D.
- Usunąć nadmiar buforu D za pomocą igły strzykawki, eluować 200 mikrolitrami odpowiedniego buforu elucyjnego pod ciągłym wstrząsaniem.
- Następnie zagęścić białka za pomocą 30 mikrolitrów wiru żywicy absorpcyjnej.
- Załaduj pozostałe 45 mikrolitrów na stronę SDS w postaci barwnika żelowego. Żel do stron SDS z koloidalnym blaskiem kamasi w kolorze niebieskim.
- Teraz za pomocą czystego skalpela wytnij interesujący nas pasek z żelu, pokrój żel w kostkę w kostkę o długości od dwóch do czterech milimetrów i przenieś próbkę do probówki.
- Odwodnić próbkę 100% nitrylem acetonowym przez pięć minut i usunąć wolny płyn.
- Następnie, aby zredukować wiązania białkowe di siarczkowe przy 10 milimolowych DTT i inkubować przez 30 do 45 minut w temperaturze 56 stopni Celsjusza z potrząsaniem, usuń teraz wolny płyn do alkilowania reszty cysteiny.
- Usuń wolny płyn, a następnie umyj kawałki żelu dwukrotnie 50% nitrylem aceto przez 10 minut. Usuń wolny płyn.
- Teraz odwodnij kawałki żelu 100% nitrylem acetonowym przez pięć minut i usuń wolny płyn do Tryptyku Digest.
- Inkubować w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez noc, aby zatrzymać trawienie i ekstrahować peptydy z kawałków żelu w 5% sonikacji kwasu mrówkowego przez pięć do 10 minut.
- Następnie przenieś supernat do nowej probówki, wysusz peptydy przez liofilizację lub koncentrator próżniowy i przechowuj próbki w temperaturze minus 20 stopni Celsjusza.
Identyfikacja miejsc fosforylacji PTO
Całkowita ilość białka PTO składającego się zarówno z kompleksu PRF, jak i wolnej formy została immunologicznie wytrącona za pomocą Anti-Flag M two aros i poddana frakcjonowaniu strony SDS, trawieniu tryptykowi ingel i analizie spektrometrii mas w wyniku uzyskania peptydów PTO obejmujących około 80% jego sekwencji.
Co ciekawe, zidentyfikowano zestaw pojedynczych miejsc fosforylacji peptydów PTO. Należy zauważyć, że miejsca podwójnej fosforylacji zostały zidentyfikowane tylko w obecności któregokolwiek z białek efektorowych.
Pamiętaj, że modyfikacje mapowania, takie jak fosforylacja, wymagają rozsądnej ilości białka ze spektrometrii mas, więc na żelu powinno być widoczne przynajmniej słabe pasmo Postępując zgodnie z tą procedurą.
tags: #potranslacyjna #modyfikacja #białek #filtracja
