Spektrometria Masowa: Zasada Działania i Jonizacja

Szczegóły: Opublikowano: 21. March 2026

Spektrometria masowa (ang. Mass Spectrometry, MS) to technika analityczna pozwalająca na dokładny pomiar stosunku masy do ładunku elektrycznego jonu, co, przy znanym ładunku jonu pozwala obliczyć masę z dokładnością do pojedynczych atomów.

Wprowadzenie i Zastosowanie

Do lat 70-tych XX w. masy białek szacowano metodami takimi jak: elektroforeza, chromatografia, ultrawirowanie. Jednak wyniki uzyskiwane tymi metodami były nieprecyzyjne, a błąd wynosił 10 - 100%. Wprowadzenie techniki MS umożliwiło znaczny postęp w tej dziedzinie. Zakres zastosowania: od peptydów do dużych białek (>200 kDa).

Zasada Działania

Podstawowym warunkiem zastosowania spektrometrii mas jest posiadanie przez badane cząsteczki ładunku. Cząsteczka musi być jonem! Jeśli próbka zawiera cząsteczki obojętne należy nadać im ładunek poprzez jonizację. Jonizacja cząsteczek umożliwia przyspieszenie ich w polu elektrycznym w próżni. Wiązka przyspieszonych jonów wpada w jednorodne pole magnetyczne o wektorze indukcji B i ulega odchyleniu.

Za pomocą pola magnetycznego, działającego na monoenergetyczną wiązkę jonów, można wyznaczać stosunki m/z, a przy znanym ładunku jonów wprost ich masy. Heterogeniczny strumień jonów można rozdzielić na składowe, zależnie od stosunku masy do ładunku [math](\nicefrac mz)[/math].

W przypadku jonizacji polegającej na protonacji lub deprotonacji masa mierzona w spektrometrze będzie powiększona lub pomniejszona o masę protonu lub protonów przyłączonych lub odłączanych od cząsteczki analizowanej substancji.

Przeczytaj także: ESI(+) w Spektrometrii Masowej: Podstawy

Rozdzielczość jest zdefiniowana jako [math]R = \frac M{\Delta M}[/math], gdzie [math]\Delta M\;[/math] jest określona dla sąsiadujących, rozróżnialnych mas [math]M\;[/math] i [math]M+\Delta M\;[/math]. Rozdzielczość 100 000 umożliwia np.

Dokładność wyznaczenia masy cząsteczkowej jest zdefiniowana jako różnica pomiędzy zmierzoną i obliczoną masą dla danego jonu.

Monoizotopowe piki uzyskuje się dla cząsteczek, w których występuje jeden izotop pierwiastka. W rzeczywistości cząsteczki jednego związku mogą mieć masy różniące się ze względu na obecność w cząsteczce różnych izotopów np. Dla cząsteczek biologicznych zawierających setki atomów węgla i azotu widmo masowe staje się bardzo skomplikowane. Jego rozkład można przewidzieć teoretycznie.

Metody Jonizacji

Jony tworzą się pod wpływem bombardowania substancji elektronami, atomami, jonami. Konieczne jest przeprowadzenie badanej substancji w stan pary. Jonizacja odbywa się w próżni. Metoda ta powoduje zwykle fragmentację badanych cząsteczek.

Jonizacja Elektronami (EI)

Po przyłożeniu napięcia katoda emituje elektrony o ściśle określonej energii, które zderzając się z cząsteczkami próbki wybijają elektron lub elektrony z ich orbit walencyjnych. Postać wyników: piki jonów molekularnych obserwowane w widmie masowym posiadają zazwyczaj ładunek +1. Najczęściej stosowany zakres analizy to 10-1000 Da - cząsteczki o wyższych masach ulegają łatwo dekompozycji przy stosowaniu jonizacji typu EI.

Przeczytaj także: Profesjonalna stylizacja włosów w domu

Jonizacja Chemiczna (CI)

W wyniku jonizacji wiązką elektronów gazu buforowego (najczęściej jest nim metan) pod ciśnieniem 10-4 mm Hg powstają jony molekularne CH5+, które następnie jonizują cząsteczki analizowanej substancji. Gaz buforowy jest obecny w dużym nadmiarze (~ 100 razy) w stosunku do analizowanej substancji. Jest to stosunkowo delikatny sposób jonizacji, pozwala na zmniejszenie stopnia fragmentacji cząsteczki, produkuje jony MH+. Jony te ulegają w małym stopniu dalszemu rozpadowi, gdyż nie mają one dużego nadmiaru energii wewnętrznej.

MALDI (Matrix-Assisted Laser Desorption/Ionization)

Analizowana substancja jest rozpuszczana w lotnym rozpuszczalniku, a następnie mieszana z roztworem matrycy (roztwór cząstek organicznych absorbujących promieniowanie laserowe). Mieszaninę nanosi się na płytkę ze stali nierdzewnej i pozwala odparować rozpuszczalnikowi w strumieniu powietrza. Po wysuszeniu próbkę wprowadza się do komory pomiarowej i usuwa powietrze. Następnie próbkę naświetla się impulsami lasera, co powoduje wzbudzenie matrycy. Skoncentrowany impuls laserowy trwający ok. Technika MALDI jest zaliczana do łagodnych sposobów jonizacji, pokrewnych jonizacji chemicznej. Metoda ta jest stosowana głównie do sekwencjonowania peptydów i określania masy cząsteczkowej białek. Zakres analizy to 500 - 1000000 Da. Najczęściej analizowane są średnio- i wysokocząsteczkowe substancje organiczne, peptydy, białka, polimery, kwasy nukleinowe. Postać wyników: najczęściej jonizacja +1, rzadziej +2, możliwość obserwacji niekowalencyjnych kompleksów.

Elektrosprej (ESI - Electrospray Ionization)

Pierwszym etapem jest jonizacja próbki w stanie ciekłym pod ciśnieniem atmosferycznym w silnym polu elektrycznym (napięcia rzędu 2000-5000 V). Na powierzchni cieczy opuszczającej kapilarę akumulują się ładunki. Kolejnym etapem jest odparowanie rozpuszczalnika. Najczęściej analizowane próbki: średnio- i wysokocząsteczkowe substancje organiczne, peptydy, białka, polimery, kwasy nukleinowe w postaci ciekłej o zakresie mas 50 - 80000 Da. Metodę jonizacji ESI stosuje się w biochemii, biotechnologii, farmakologii, neurochemii, medycynie sądowej, oraz w detekcji w chromatografii cieczowej.

FAB (Fast Atom Bombardment)

Metoda FAB jest stosowana w przypadku jonów zawartych w nielotnych rozpuszczalnikach, takich jak gliceryna, alkohol m-nitrobenzymowy. Wiązka szybkich atomów (argonu, ksenonu) uzyskiwana jest z wykorzystaniem jonów (np. cezu). Przyspieszane jony trafiają do komory zderzeniowej, gdzie przekazują atomom pęd. Obojętne atomy uderzają w roztwór analizowanej substancji wyrzucając z roztworu jony i cząsteczki obojętne. Wyrzucane jony są kierowane do analizatora.

Analizator Czasu Przelotu (TOF - Time-of-Flight)

Powstałe jony są wprowadzane do analizatora, gdzie pod wpływem impulsu elektrycznego ulegają przyspieszeniu i zaczynają przemieszczać się w kierunku detektora jonów połączonego z urządzeniem rejestrującym czas od impulsu przyspieszającego do momentu uderzenia określonego jonu w detektor. Czas przelotu jest przeliczany na stosunek [math]\nicefrac mz[/math]. Rozdzielczość analizatora początkowo wynosiła < 1000. Obecnie stosuje się analizatory ze zwierciadłem elektrostatycznym, które zwiększa rozdzielczość aparatu do kilkudziesięciu tysięcy, ale zmniejsza zakres dopuszczalnych mas cząsteczkowych.

Przeczytaj także: Wszystko o prostownicy z laserową jonizacją

Spektrometria Mas Tandemowych (MS/MS)

Podstawowy układ składa się z dwóch spektrometrów masowych. Za pomocą pierwszego spektrometru selekcjonuje się wybrany jon (najczęściej jon molekularny) na podstawie stosunku [math]\nicefrac mz[/math]. Jon ten (macierzysty, parent ion) poddawany jest zderzeniom np. z wprowadzonym gazem obojętnym. Na skutek zderzeń jon macierzysty rozpada się na jony fragmentacyjne (daughter ions), które można analizować za pomocą drugiego spektrometru.

Analizatory Mas

Istnieje kilka typów analizatorów mas, z których każdy ma swoje specyficzne cechy i zastosowania:

Sektor Magnetyczny: Umożliwia pomiary zmiany toru lotu jonów w polu magnetycznym. Stopień zakrzywienia toru zależy od stosunku masy do ładunku ([math]\nicefrac mz[/math]), prędkości jonu i od parametrów pola magnetycznego. Sektor magnetyczny charakteryzuje się niską rozdzielczością (< 5000) związaną z dużymi różnicami prędkości cząsteczek wpadających do urządzenia.
Sektor Elektryczny: Zbudowany z dwóch równoległych, zakrzywionych płyt do których przyłożono potencjał elektryczny umożliwiający przyspieszanie jonów. Jony o jednakowej prędkości mają jednakowe tory lotu w sektorze elektrycznym.
Kwadrupol: Zbudowany z czterech symetrycznie ułożonych równoległych prętów. Działa jako filtr masy - w jednym momencie przepuszcza tylko jony o określonym stosunku masy do ładunku ([math]\nicefrac mz[/math]). Dzieje się to dzięki przykładaniu do prętów prądu zmiennego o określonej częstotliwości i napięciu oraz napięcia stałego. Kwadrupol można ustawić tak, aby przepuszczał jony o szerokim lub wąskim zakresie [math]\nicefrac mz[/math].
Pułapka Jonowa (Ion trap - IT): Analizator pozwalający na przetrzymywanie jonów. Działa na zasadzie podobnej do kwadrupola. Manipulując parametrami prądu przyłączonego do elektrod można uwięzić w pułapce jony o określonym stosunku masy do ładunku ([math]\nicefrac mz[/math]) lub jony o szerokim zakresie [math]\nicefrac mz[/math]. Pomiaru masy dokonuje się przez uwięzienie w pułapce jonów o szerokim zakresie [math]\nicefrac mz[/math] i wyrzucanie z pułapki kolejnych grup jonów o określonym [math]\nicefrac mz[/math].
Analizator Cyklotronowego Rezonansu Jonów (Ion Cyclotron Resonance ICR): W tym typie analizotora jony są pułapkowane w cyklotronie, gdzie wpadają w ruch kołowy. Widmo [math]\nicefrac mz[/math] jest tworzone przez działanie na jony polem elektromagnetycznym o zmieniającej się częstotliwości i rejestrację zmian natężenia prądu w płytach detektorowych lub zmiany absorpcji fali elektromagnetycznej. W analizatorze panuje bardzo wysoka próżnia - ciśnienie nie większe niż 10-4 Pa, zwykle 10-6 Pa lub mniejsze.
Analizator Cyklotronowego Rezonansu Jonów z Transformacją Fouriera (Fourier Transform Ion Cyclotron Resonance FT-ICR): Działa podobnie jak analizator cyklotronowego rezonansu jonowego. W analizatorze FT-ICR zastosowano bardziej wydajną metodę zbierania danych niż w ICR. Przy pomocy złożonej fali elektromagnetycznej wzbudzane są jednocześnie wszystkie jony. Na płytach detektora rejestrowany jest sygnał zawierający wiele częstotliwości charakterystycznych dla jonów o różnym [math]\nicefrac mz[/math], który nastepnie jest przekształcany w widmo [math]\nicefrac mz[/math] przy pomocy transformacji Fouriera. Analizatory FT-ICR są znacznie szybsze niż analizatory ICR, inne parametry (rozdzielczość, czułość itp.) są podobne.

Detektory Jonów

Zadaniem detektorów jest rejestracja jonów przechodzących przez analizator. Do najczęściej stosowanych detektorów należą:

Puszka Faradaya: Metalowa, cylindryczna komora z otworem przez który wlatują jony. Gdy jony docierają do dna puszki oddają jej swój ładunek, co powoduje przepływ niewielkiego prądu podlegającego rejestracji.
Powielacz Elektronowy: Detektor zbudowany z serii płytek, do których przyłączono wysokie napięcie. Jony po uderzeniu w pierwszą płytkę (dynodę konwersyjną), powodują emisję elektronów, które z kolei uderzają w następną płytkę (dynodę) powodując wybicie większej liczby elektronów. W ten sposób sygnał jest kaskadowo wzmacniany i trafia ostatecznie na anodę powodując przepływ rejestrowanego prądu. W nowszych konstrukcjach powielaczy elektronowych serię dynod zastępuje się zakrzywioną zwężającą się rurą (powielacz elektronowy o dynodzie ciągłej). Elektrony uderzają wielokrotnie w ściany rury powodując emisję kolejnych elektronów.
Detektor Mikrokanalikowy: Zbudowany jest z płytki z niewielkimi (4-25 μm), zakrzywionymi otworami. Powierzchnia otworów pokryta jest półprzewodnikiem mającym zdolność emisji elektronów. Na stronie wejściowej płytki utrzymywany jest potencjał ujemny (napięcie rzędu 1 kV) w stosunku do strony wyjściowej. Jony wpadają do kanalików i zderzają się ze ścianami otworów powodując kaskadową emisję elektronów, podobnie jak w powielaczu elektronowym. Za każdym z kanalików znajduje się metalowa anoda zbierająca elektrony.
Detektor Fotopowielaczowy: Składająca się z dwóch dynod konwersyjnych (jedna dla jonów dodatnich druga dla jonów ujemnych), ekranu fluorescencyjnego i fotopowielacza. Jony wpadające do detektora uderzają w dynodę konwersyjną powodując emisję elektronów. Elektrony są kierowane na ekran fluorescencyjny przy pomocy pola elektrycznego. Po uderzeniu elektronu w ekran emitowane są fotony, które trafiają do fotopowielacza.

Zastosowanie Spektrometrii Mas w Badaniach Białek

Etapem milowym w zastosowaniu spektrometrii mas w badaniach struktury i funkcji białek było wynalezienie metod łagodnej jonizacji. Przy wysokiej dokładności pomiarów wymaga niewielkich ilości i objętości próbki białka. Umożliwia detekcję z dokładnością do pojedynczych aminokwasów (mutageneza, modyfikacje posttranslacyjne, np.

Ograniczenia i Wyzwania

Jak każda metoda doświadczalna ma ona pewne ograniczenia i wady. Aby uzyskać wiarygodne wyniki próbka musi być idealnie czysta. Z tym wymaganiem łączą się trudności z selektywną analizą mieszanin. W przypadku dużych białek widma są skomplikowane i trudne do interpretacji.

Dynamika fałdowania białek - pomiędzy białkami a otoczeniem zachodzi stała wymiana wodorów amidowych. Jej szybkość zależy od struktury białka. Jeśli białko umieścimy w D2O zaobserwujemy wymianę protonu na deuter. W przypadku białka rozwiniętego wymiana wodorów na deuter zachodzi z podobną szybkością dla wszystkich aminokwasów. zaangażowanie wodoru amidowego w tworzenie struktur globalnych (np.

W metodzie ESI białka zjonizowane w stanie natywnym posiadają węższy rozkład stanów i mniejszy ładunek niż białka zjonizowane w stanie zdenaturowanym.

Synteza peptydów, projektowanie antybiotyków, nietypowych ligandów polega na stopniowym blokowaniu, odblokowywaniu i aktywacji gryp aminowych i karboksylowych w białkach. W trakcie syntezy mogą pojawiać się następujące problemy: delecja peptydów, niekompletne zablokowanie, utlenianie metioniny, trifluoroacetylacja seryny. Zmiany mas z tym związane są widoczne w widmach MS.

W obecności 5 mM Mg2+ zarejestrowano rybosomy 70S.

Zamrożona tkanka jest cięta na cienkie plastry i umieszczana na metalowej płytce pokrytej materiałem absorbującym UV. Następnie oświetlana jest punktowo (przemiatana) laserem. Na skutek absorpcji energii wybijane są cząsteczki budujące tkankę. W kolejności wybicia cząsteczki analizowane są metodami spektroskopii masowej.

tags: #jonizacja #cl #spektrometria #mas #zasada #działania