Jonizacja Typu Elektrosprej (ESI): Zasada Działania i Zastosowania w Spektrometrii Masowej
- Szczegóły
Spektrometria masowa (MS) to technika analityczna pozwalająca na dokładny pomiar stosunku masy do ładunku elektrycznego jonu, co, przy znanym ładunku jonu, pozwala obliczyć masę z dokładnością do pojedynczych atomów. Podstawowym warunkiem zastosowania spektrometrii mas jest posiadanie przez badane cząsteczki ładunku. Cząsteczka musi być jonem! Jeśli próbka zawiera cząsteczki obojętne należy nadać im ładunek poprzez jonizację.
Zasada Działania Jonizacji Elektrosprej (ESI)
Pierwszym etapem jonizacji elektrosprej jest jonizacja próbki w stanie ciekłym pod ciśnieniem atmosferycznym w silnym polu elektrycznym (napięcia rzędu 2000-5000 V). Na powierzchni cieczy opuszczającej kapilarę akumulują się ładunki. Kolejnym etapem jest odparowanie rozpuszczalnika.
Zastosowanie Metody ESI
Metodę jonizacji ESI stosuje się w biochemii, biotechnologii, farmakologii, neurochemii, medycynie sądowej, oraz w detekcji w chromatografii cieczowej. Najczęściej analizowane próbki to średnio- i wysokocząsteczkowe substancje organiczne, peptydy, białka, polimery, kwasy nukleinowe w postaci ciekłej o zakresie mas 50 - 80000 Da.
Specyfika Spektrometrii Masowej
Do lat 70-tych XX w. masy białek szacowano metodami takimi jak: elektroforeza, chromatografia, ultrawirowanie. Jednak wyniki uzyskiwane tymi metodami były nieprecyzyjne, a błąd wynosił 10 - 100%. Wprowadzenie techniki MS umożliwiło znaczny postęp w tej dziedzinie. Zakres zastosowania: od peptydów do dużych białek (>200 kDa).
Proces Pomiaru w Spektrometrii Masowej
Jonizacja cząsteczek umożliwia przyspieszenie ich w polu elektrycznym w próżni. Wiązka przyspieszonych jonów wpada w jednorodne pole magnetyczne o wektorze indukcji B i ulega odchyleniu. Za pomocą pola magnetycznego, działającego na monoenergetyczną wiązkę jonów, można wyznaczać stosunki m/z, a przy znanym ładunku jonów wprost ich masy. Heterogeniczny strumień jonów można rozdzielić na składowe, zależnie od stosunku masy do ładunku [math](\nicefrac mz)[/math]. W przypadku jonizacji polegającej na protonacji lub deprotonacji masa mierzona w spektrometrze będzie powiększona lub pomniejszona o masę protonu lub protonów przyłączonych lub odłączanych od cząsteczki analizowanej substancji.
Przeczytaj także: Profesjonalna stylizacja włosów w domu
Rozdzielczość jest zdefiniowana jako [math]R = \frac M{\Delta M}[/math], gdzie [math]\Delta M\;[/math] jest określona dla sąsiadujących, rozróżnialnych mas [math]M\;[/math] i [math]M+\Delta M\;[/math]. Dokładność wyznaczenia masy cząsteczkowej jest zdefiniowana jako różnica pomiędzy zmierzoną i obliczoną masą dla danego jonu.
Monoizotopowe piki uzyskuje się dla cząsteczek, w których występuje jeden izotop pierwiastka. W rzeczywistości cząsteczki jednego związku mogą mieć masy różniące się ze względu na obecność w cząsteczce różnych izotopów np. Dla cząsteczek biologicznych zawierających setki atomów węgla i azotu widmo masowe staje się bardzo skomplikowane. Jego rozkład można przewidzieć teoretycznie.
Inne Metody Jonizacji
Jony tworzą się pod wpływem bombardowania substancji elektronami, atomami, jonami. Konieczne jest przeprowadzenie badanej substancji w stan pary. Jonizacja odbywa się w próżni. Metoda ta powoduje zwykle fragmentację badanych cząsteczek.
W wyniku jonizacji wiązką elektronów gazu buforowego (najczęściej jest nim metan) pod ciśnieniem 10-4 mm Hg powstają jony molekularne CH5+, które następnie jonizują cząsteczki analizowanej substancji. Gaz buforowy jest obecny w dużym nadmiarze (~ 100 razy) w stosunku do analizowanej substancji. Jest to stosunkowo delikatny sposób jonizacji, pozwala na zmniejszenie stopnia fragmentacji cząsteczki, produkuje jony MH+. Jony te ulegają w małym stopniu dalszemu rozpadowi, gdyż nie mają one dużego nadmiaru energii wewnętrznej.
Analizowana substancja jest rozpuszczana w lotnym rozpuszczalniku, a następnie mieszana z roztworem matrycy (roztwór cząstek organicznych absorbujących promieniowanie laserowe). Mieszaninę nanosi się na płytkę ze stali nierdzewnej i pozwala odparować rozpuszczalnikowi w strumieniu powietrza. Po wysuszeniu próbkę wprowadza się do komory pomiarowej i usuwa powietrze. Następnie próbkę naświetla się impulsami lasera, co powoduje wzbudzenie matrycy. Technika MALDI jest zaliczana do łagodnych sposobów jonizacji, pokrewnych jonizacji chemicznej. Metoda ta jest stosowana głównie do sekwencjonowania peptydów i określania masy cząsteczkowej białek. Zakres analizy to 500 - 1000000 Da. Najczęściej analizowane są średnio- i wysokocząsteczkowe substancje organiczne, peptydy, białka, polimery, kwasy nukleinowe.
Przeczytaj także: Wszystko o prostownicy z laserową jonizacją
Metoda FAB jest stosowana w przypadku jonów zawartych w nielotnych rozpuszczalnikach, takich jak gliceryna, alkohol m-nitrobenzymowy. Wiązka szybkich atomów (argonu, ksenonu) uzyskiwana jest z wykorzystaniem jonów (np. cezu). Przyspieszane jony trafiają do komory zderzeniowej, gdzie przekazują atomom pęd. Obojętne atomy uderzają w roztwór analizowanej substancji wyrzucając z roztworu jony i cząsteczki obojętne. Wyrzucane jony są kierowane do analizatora.
Analizatory i Detektory w Spektrometrii Masowej
Powstałe jony są wprowadzane do analizatora, gdzie pod wpływem impulsu elektrycznego ulegają przyspieszeniu i zaczynają przemieszczać się w kierunku detektora jonów połączonego z urządzeniem rejestrującym czas od impulsu przyspieszającego do momentu uderzenia określonego jonu w detektor. Czas przelotu jest przeliczany na stosunek [math]\nicefrac mz[/math].
Rodzaje Analizatorów
- Sektor magnetyczny
- Sektor elektryczny
- Kwadrupol
- Pułapka jonowa (Ion trap - IT)
- Analizator cyklotronowego rezonansu jonów (Ion Cyclotron Resonance ICR)
- Analizator cyklotronowego rezonansu jonów z fourierowską transformacją wyników (Fourier Transform Ion Cyclotron Resonance FT-ICR)
Detektory
- Puszka Faradaya
- Powielacz elektronowy
- Detektor mikrokanalikowy
- Detektor fotopowielaczowy
Zastosowania i Ograniczenia Metody
Etapem milowym w zastosowaniu spektrometrii mas w badaniach struktury i funkcji białek było wynalezienie metod łagodnej jonizacji. Przy wysokiej dokładności pomiarów wymaga niewielkich ilości i objętości próbki białka. Umożliwia detekcję z dokładnością do pojedynczych aminokwasów (mutageneza, modyfikacje posttranslacyjne, np.
Jak każda metoda doświadczalna ma ona pewne ograniczenia i wady. Aby uzyskać wiarygodne wyniki próbka musi być idealnie czysta. Z tym wymaganiem łączą się trudności z selektywną analizą mieszanin. W przypadku dużych białek widma są skomplikowane i trudne do interpretacji.
Przykłady Zastosowań
- Dynamika fałdowania białek
- Synteza peptydów, projektowanie antybiotyków, nietypowych ligandów
- Analiza rybosomów
- Analiza tkanek
Przeczytaj także: Pyły zawieszone, filtry i jonizacja w oczyszczaczach powietrza
tags: #jonizacja #typu #elektrosprej #zasada #działania
