Filtracja Przeciwciał po Oczyszczeniu Metodą Filtracji Żelowej (SEC)
- Szczegóły
Filtracja żelowa, zwana również chromatografią wykluczania (ang. size-exclusion chromatography - SEC), jest podstawową techniką charakteryzacji białek, wykorzystywaną w środowisku akademickim lub farmaceutycznym.
Systemy Jednodetektorowe SEC: Zalety i Ograniczenia
Najczęściej do analiz, a w szczególności do wykrywania agregatów wykorzystuje się jednodetektorowe systemy SEC. Systemy jednodetektorowe zawierają zazwyczaj detektor UV i są wykorzystywane do badania białek i identyfikacji obecności agregatów. Jednodetektorowe systemy filtracji żelowej SEC są szeroko stosowane i popularne m.in. dzięki swojej powtarzalności i odtwarzalności.
Jednakże warto mieć na uwadze, że w przypadku zastosowania jednego detektora możemy również napotkać pewne ograniczenia tej techniki. Niemniej, dostarcza ona jedynie ograniczonych informacji. Mogą istnieć różnice pomiędzy próbkami, które nie są widoczne przy użyciu samego UV-SEC. Na przykład, to co wydaje się być prostym pikiem agregatu, może być oligomerem lub większym, bardziej nieuporządkowanym agregatem.
Wielodetektorowe Systemy SEC: Rozszerzone Możliwości
Problem ograniczeń jednodetektorowych systemów SEC rozwiązano, rozbudowując system o dodatkowe detektory, co pozwoliło uzyskać wiele cennych informacji. Detektory rozpraszające światło, zarówno SEC-MALS (wielokątowe rozpraszanie światła), RALS (prawostronne rozpraszanie światła), jak i LALS (niskokątowe rozpraszanie światła), mierzą bezwzględną masę cząsteczkową z dużą dokładnością.
Dodanie detektora rozpraszającego światło sprawi, że wszystkie pomiary masy cząsteczkowej będą dokładne bez względu na rodzaj mierzonego białka. Pomiar bezwzględnej masy cząsteczkowej dostarcza wiarygodnej oceny stanu oligomerycznego białka. Wiele białek łączy się w multimery złożone z dwóch lub więcej podjednostek, co wpływa na ich aktywność lub stabilność. Poznanie bezwzględnej masy cząsteczkowej białka umożliwia lepszą kontrolę nad jego zachowaniem i stabilnością, a w konsekwencji zapewnia lepszą jakość produktu.
Przeczytaj także: Definicja i pomiar filtracji kłębuszkowej
Zaawansowane, wielodetektorowe systemy SEC poprzez kompleksową charakterystykę białek są narzędziem pozwalającym pracować szybciej i efektywniej. Dzięki temu jakość biofarmaceutyków jest na najwyższym poziomie. To nieoceniona pomoc dla działów R&D, od których wymaga się szybkich i dokładnych wyników. Pomiar za pomocą systemu wielodetektorowego pozwala w krótszym czasie otrzymać bardziej kompleksowe wyniki.
Analiza Agregatów Białkowych
Wielodetektorowa chromatografia żelowa (filtracja żelowa) może wykraczać poza proste wykrywanie niezidentyfikowanych agregatów w próbce. Może mierzyć ich masę cząsteczkową i polidyspersyjność (czy są to agregaty o jednej masie cząsteczkowej, czy o różnych masach). Może nam również powiedzieć o ich strukturze lub czy te agregaty są globularne, cząsteczkowe, wydłużone lub włókniste.
Użycie detektorów rozpraszania światła pozwala szybko rozróżnić i określić ilościową zawartość oligomerów i większych agregatów. Agregaty białkowe występują w różnych kształtach, rozmiarach, strukturach i konformacjach. Oligomery, same w sobie, są często włączane do szerszego opisu „agregatów”. Oligomery są zazwyczaj odróżniane od innych agregatów przez ich stabilną masę cząsteczkową i aktywność.
Wpływ Agregatów na Działanie Terapeutyczne
W przypadku badań klinicznych po podaniu pacjentowi, reakcje na oligomery i większe, bardziej nieuporządkowane agregaty mogą być znaczące i różnić się działaniem terapeutycznym. Oligomery mogą mieć większą lub mniejszą aktywność niż sam monomer, podczas gdy większe, nieuporządkowane agregaty będą zmniejszać jego skuteczność (poprzez redukcję miejsc aktywnych cząsteczek) i mogą mieć immunogenne skutki uboczne.
Założenia dotyczące agregacji oparte na pomiarach jednodetektorowych mogą prowadzić do błędnych wniosków na temat danej próbki białka.
Przeczytaj także: Webber AP8400 - wymiana filtrów
Pomiary Lepkości Wewnętrznej
Lepkość właściwa jest miarą struktury, konformacji i upakowania cząsteczki. W przypadku białek jest to bezpośrednio związane z ich globularnością. Powszechnie spotykanie białka globularne mają niską lepkość wewnętrzną (wysoki stopień upakowania). Charakteryzując lepkość wewnętrzną białka, można zebrać informacje na temat jego konformacji i upakowania.
Duże zmiany konformacyjne, które zachodzą w wyniku zmian środowiskowych lub wiązania innych cząsteczek, mogą być również monitorowane w celu wykrycia procesu fałdowania wewnętrznie nieuporządkowanego białka. Ostatecznie, informacje na temat lepkości wewnętrznej mogą być połączone z innymi pomiarami (na przykład z dynamicznym rozpraszaniem światła (DLS) lub analitycznego ultrawirowania (AUC)) w celu zbadania kształtu i stanu uwodnienia białka.
Zastosowanie w Przemyśle Biofarmaceutycznym
Szereg laboratoriów biofarmaceutycznych wykorzystuje technikę wielodetektorowej filtracji żelowej do zdiagnozowania problemów produkcyjnych. Dzięki temu możliwa jest szybsza identyfikacja i rozwiązanie problemów produkcyjnych, zapewniając tym samym wysoką jakość wyrobu końcowego oraz ciągłość produkcji.
Zakłady przemysłowe coraz częściej stawiają na wielodetektorowe systemy filtracji żelowej w swoich działach R&D.
Niezależnie od branży, najlepszym sposobem na wyprzedzenie konkurencji jest otrzymanie najlepszych wyników zmierzonych za pomocą najbardziej profesjonalnego urządzenia. Niezależnie od tego, czy produkujesz biofarmaceutyki w przemyśle, stosujesz je w preparatach, czy prowadzisz badania skupiające się na oczyszczaniu i charakteryzacji nowych białek, systemy wielodetektorowe mają znaczącą przewagę nad jednodetektorowymi. Dostarczane przez wielodetektorowe systemy filtracji żelowej informacje pozwalają lepiej zrozumieć naturę i w pełni scharakteryzować białko. Przekłada się to na lepszą jakość i kontrolę produktów, a przez to na bardziej zadowolonych klientów.
Przeczytaj także: Optymalne rozcieńczenie bimbru
Wymogi Regulacyjne
Agencja Żywności i Leków (FDA) coraz częściej wymaga, aby w przypadku związków biologicznie czynnych używanych jako leków, chromatogramom UV towarzyszyła analiza rozpraszania światła. Daje to pewność, że źródło i właściwości wszelkich agregatów w próbce są dobrze poznane, a ryzyko wystąpienia niepożądanych objawów u pacjenta minimalne.
Przykład: Analiza Anhydrazy Węglanowej
Na rysunku 2 pokazano chromatogram anhydrazy węglanowej. Próbka składa się z czterech populacji. Dzięki dokładności zmierzonych mas cząsteczkowych (przedstawionych w tabeli 1) - piki 2, 3 i 4 mogą być łatwo zidentyfikowane odpowiednio jako trimer, dimer i monomer. Stabilność zmierzonych mas cząsteczkowych w poszczególnych pikach wyraźnie wskazuje na to, że mamy do czynienia z odrębnymi populacjami. Masa cząsteczkowa piku 1 jest wyższa i bardziej zróżnicowana, co wskazuje na występowaniu większych aglomeratów. Możliwy jest również pomiar zawartości procentowej każdego piku w całej próbce.
Tabela 1. Zmierzona masa cząsteczkowa pików anhydrazy węglanowej
| Pik | Opis | Masa cząsteczkowa |
|---|---|---|
| 1 | Aglomeraty | Wyższa i zróżnicowana |
| 2 | Trimer | Określona |
| 3 | Dimer | Określona |
| 4 | Monomer | Określona |
Tabela 2. Chromatogram β-amylazy z powiązanymi zmierzonymi masami cząsteczkowymi.
Tabela 3. Wielodetektorowa chromatografia żelowa (filtracja żelowa) umożliwia pełną charakterystykę próbek białek
tags: #filtracja #przeciwciał #po #oczyszczeniu #metody
