Aglutynacja: Mechanizm Działania i Zastosowanie
- Szczegóły
Aglutynacja wywodzi się z łaciny od słowa aggutino, co oznacza "sklejam, zlepiam". Jest to zjawisko polegające na skupianiu się, zlepianiu cząstek nieożywionych lub komórek znajdujących się w środowisku płynnym.
Aglutynacja może zachodzić w organizmach żywych w wyniku reakcji pomiędzy antygenami i przeciwciałami. Wtedy jej skutki mogą być groźne, prowadząc do tworzenia szkodliwych agregatów. Pozytywną funkcją aglutynacji jest udział w mechanizmach immunologicznych, np. w reakcjach odpornościowych z udziałem p-ciała i dopełniacza (np. opsonizacja bakterii).
Swoistą i niewidoczną fazą aglutynacji jest wiązanie submikroskopowych cząsteczek (molekuł): przeciwciał z odpowiednimi antygenami. Jeżeli antygeny umocowane są na powierzchni większych struktur żywych: komórek, bakterii lub martwych, np.
Wspomniane przeciwciała są białkami o bardzo wyspecjalizowanej strukturze, które naturalnie wytwarzane są w organizmie przez układ odpornościowy w odpowiedzi na pojawienie się czynników rozpoznanych jako obce - w jakiś sposób zagrażające organizmowi.
Czynniki, na które układ odpornościowy reaguje, określane są jako antygeny. Inaczej mówiąc, antygeny są substancjami powodującymi reakcję układu odpornościowego i reagującymi swoiście z produktami tej odpowiedzi, np. przeciwciałami.
Przeczytaj także: Kluczowe różnice w osmozie biernej i czynnej
Łączone przez powstały kompleks nośniki antygenu (naturalne lub sztuczne) tworzą struktury widoczne pod lupą lub nawet gołym okiem w postaci agregatów komórek, grudek, kłaczków „wypadających” z roztworu itd.
Ze względów praktycznych przeciwciała uczestniczące w reakcji aglutynacji określa się jako aglutyniny. Aglutynacja ma szerokie zastosowanie w medycynie.
Wykorzystywana jest m.in. identyfikacji antygenów przy użyciu znanych przeciwciał (diagnostyka mikrobiologiczna np. szczepów bakterii zakaźnych, tzw. wykrywania przeciwciał na znane antygeny (badanie serokonwersji, np. oznaczania stężenia przeciwciał, tzw.
Zjawisko aglutynacji jest wykorzystywane w teście lateksowym. Nośnikiem swoiście reagujących elementów i zarazem markerem zajścia reakcji są cząstki lateksu.
Reakcje Precypitacji
Reakcje precypitacji - antygeny biorące udział w reakcji to antygeny białkowe, zarówno pełnowartościowe jak i resztkowe (hapteny); cechą charakterystyczną jest ich wielowartościowość (jednowartościowe, posiadające tylko jedną determinantę antygenową [EPITOP] nie precypitują, choć też nie wszystkie wielowartościowe precypitują) oraz to, że są rozpuszczalne (w przeciwieństwie do antygenów biorących udział w aglutynacji!); przeciwciała biorące udział w reakcji precypitacji noszą nazwę precypityn.
Przeczytaj także: Sterowniki i usterki ASUS K52J
Przeciwciała o bardzo wąskiej strefie ekwiwalencji (wąski zakres stężeń reagentów, w którym ulegają one precypitacji) nazywamy przeciwciałami flokulującymi.
Przykłady Odczynów Precypitacyjnych:
- Odczyn precypitacji pierścieniowej: Do probówek wprowadzamy surowicę odpornościową i ostrożnie nawarstwiamy roztwór, w którym poszukujemy antygenu.
- Odczyn precypitacji szkiełkowej: Na szkiełko przedmiotowe nakraplamy roztwór antygenu i surowicy i intensywnie mieszamy.
- Odczyn flokulacyjny: Zasadą tego odczynu jest reakcja przeciwciał obecnych w surowicy chorego z antygenem kardiolipinowym (otrzymywany z mięśnia serca wołu → wspólny dla prawidłowego serca bydlęcego jak i krętków kiły).
Zinaktywowaną surowicę badaną nakraplamy do zagłębienia szkiełka Lindnera (szkiełko z łezką) i dodajemy zawiesinę antygenu kardiolipinowego (opłaszczone kardiolipiną cząsteczki cholesterolu). Wytrząsamy i oceniamy pod mikroskopem obecność kłaczków (pojawiają się gdy w surowicy obecne są przeciwciała dla kiły).
Immunodyfuzja
Pozwalają badać jednocześnie wiele układów antygen-przeciwciało; oparte są na zjawisku dyfuzji w żelu (agarowym, agarozowym lub poliakrylamidowym) - na granicy zetknięcia się dyfundujących reagentów (w ich strefie ekwiwalencji) powstają linie precypitacyjne.
Przebieg immunodyfuzji zależy od wielkości cząsteczek i ich stężenia. Optymalne pH to 6.0-9.0, temperatura zazwyczaj pokojowa.
Rodzaje Immunodyfuzji:
- Pojedyncza immunodyfuzja probówkowa: Liczba pierścieni zależy od liczby reagujących antygenów i przeciwciał (niejednorodny/jednorodny antygen, mono-/poliwalentna surowica). Na dno probówki wlewa się agar zmieszany z surowicą odpornościową i czeka na zestalenie podłoża, następnie nawarstwia się roztwór antygenu, który dyfunduje do agaru.
- Pojedyncza immunodyfuzja płytkowa (immunodyfuzja radialna, Mancini): Przeciwciała miesza się z płynnym agarem i wylewa na płytkę, po zastygnięciu wycina się studzienki i wypełnia roztworem badanego antygenu. Antygen dyfunduje pierścieniowo, tworząc pierścieniowe strefy precypitacyjne (tzw. halo) o średnicy wprost proporcjonalnej do stężenia antygenu, które można wyliczyć porównując do krzywej kalibracyjnej; stosowana do oznaczania ludzkich immunoglobulin surowicy poprzez umieszczenie w agarze np.
- Podwójna immunodyfuzja płytkowa (PDA): W żelu agarowym na płytce szklanej wycina się studzienki, do jednych wprowadza się roztwór antygenu, do drugich przeciwciała - reagenty dyfundują, a w strefie ekwiwalencji zaobserwujemy linie precypitacyjne (prosta - masy cząsteczkowe przeciwciała i antygenu są zbliżone; wygięcie w stronę danego reagentu natomiast świadczy o jego wyższej masie cząsteczkowej).
Immunoelektroforeza
- Immunoelektroforezę rakietkową wg. metody Laurella: Pozwala na ilościową ocenę poszczególnych białek; na płytkę wylewa się agar z przeciwciałami, do studzienek dodaje się badany płyn ustrojowy i poddaje elektroforezie.
- Immunoelektroforeza krzyżowa: Metoda jak rakietkowa, tylko pozwala na wykrycie kilku antygenów (pierwszy etap - elektroforeza badanego materiału na żelu, czyli rozdzielenie antygenów; drugi etap - dolanie przeciwciał i prowadzenie elektroforezy w kierunku prostopadłym do poprzedniego; w strefie ekwiwalencji dla poszczególnych antygenów powstają łuki precypitacyjne o kształcie stożków).
Aglutynacja: Szczegóły Reakcji
Aglutynacja - reakcja, w której dochodzi do zlepiania się elementów upostaciowanych (aglutynogenów, którymi mogą być komórki np. erytrocyty lub sztuczne nośniki antygenu, np.
Przeczytaj także: Zastosowanie wężyków do filtra osmozy
Przykłady Odczynów Aglutynacyjnych:
- Odczyn bezpośredni: Pozwala wykryć obecność przeciwciał niekompletnych opłaszczonych in vivo na erytrocytach (do zawiesiny erytrocytów dodaje się bezpośrednio przeciwciała antyglobulinowe, np.
- Odczyn pośredni: Pozwala wykryć obecność przeciwciał niekompletnych w surowicy (po opłaszczeniu erytrocytów wzorcowych badaną surowicą, dodajemy przeciwciała antyglobulinowe, np.
Pośredni odczyn Coombsa jest także wykorzystywany w teście Waalera-Rosego, do wykrywania obecności w surowicy czynnika reumatoidalnego RF (klasy IgM). W teście wykorzystuje się erytrocyty barana opłaszczone przeciwciałami króliczymi skierowanymi przeciwko erytrocytom barana (do opłaszczania stosuje się surowicę króliczą o stężeniu czterokrotnie mniejszym niż stężenie wywołujące aglutynację tych krwinek). Następnie inkubuje się je z kolejnymi rozcieńczeniami uprzednio zinaktywowanej surowicy badanej. Ponieważ w surowicach ludzkich znajdują się naturalne przeciwciała skierowane przeciwko białkom surowicy królika, aglutynacja może zajść nawet w przypadku nieobecności czynnika RF.
Odczyn wiązania dopełniacza: Kompleksy immunologiczne antygen-przeciwciało (IgG lub IgM) mają zdolność wiązania dopełniacza. Jeśli kompleks związany jest z erytrocytem, powoduje to jego lizę (hemoliza immunologiczna) - początkowo mętna zawiesina krwinek staje się klarowna o intensywnie czerwonym kolorze. Metodę tę stosuje się w diagnostyce wielu zakażeń bakteryjnych, grzybiczych i wirusowych. dodanie układu wskaźnikowego - erytrocytów barana i hemolizyn (tj.
Odczyn antystreptolizyny O (ASO): Antystreptolizyna O jest przeciwciałem wytwarzanym w organizmie w odpowiedzi na zakażenie paciorkowcami beta-hemolizującymi grupy A; jest swoiście skierowana przeciwko streptolizynie O (SO). Wynik podaje się w jednostkach międzynarodowych jako miano surowicy (odwrotność największego rozcieńczenia surowicy, przy którym hemoliza jeszcze nie wystąpiła) - miano do 200 j.m.
Metody Heterogenne
Metody heterogenne - jeden ze składników związany jest z fazą stałą (np. metoda bezpośrednia (Farra) - znakowany antygen inkubujemy z badanym materiałem, w którym poszukujemy przeciwciał; utworzony kompleks wytrąca się z roztworu np.
Metody immunoenzymatyczne (EIA) - znacznikami są enzymy, a produkty reakcji przeprowadzanych przez nie są barwne, co oceniamy spektrofluorymetrycznie; enzymy nie mogą występować w płynach biologicznych (stosuje się więc peroksydazę chrzanową HRP, fosfatazę alkaliczną AP, oksydazę glukozową GO); wiązane są one z białkiem (antygenem lub przeciwciałem) za pomocą aldehydu glutarowego; substratami dla reakcji jest H2O2 (redukowany do wody) i chromagen, przekształcany w barwny związek (stosowane chromageny: ortofenylenodwuamina, O-dwuanizydyna, kwas 5-aminosalicylowy i p-nitrofenylofosforan sodowy).
Test ELISA - stosowany w diagnostyce chorób zakaźnych (np.
Techniki Immunomorfologiczne
Techniki immunomorfologiczne - pozwalają wykryć obecność przeciwciała lub antygenu związanego bezpośrednio z komórką lub tkanką.
Techniki immunoenzymatyczne (EIA) - stosowanymi chromagenami zazwyczaj są tetrachlorowodorek dwuaminobenzydyny (DAB, przekształca się w ciemnobrązowy nierozpuszczalny produkt) lub 3-amino-9-etylokarbazol (AEC, przekształca się w nierozpuszczalny produkt barwy czerwonej).
Metody adherencyjne: oparte na zdolności przylegania niektórych komórek do szkła lub plastiku; zawiesinę komórek inkubuje się w kolumnach wypełnionych np.
Ocena Fenotypu
Ocena fenotypu: metody różnicowania poszczególnych subpopulacji limfocytów oparta jest na identyfikacji antygenów różnicowania CD (Cluster Differentiation), np. CD2 (komórki NK), CD3 (limfocyty T), CD4 (limfocyty T pomocnicze), CD8 (limfocyty T supresorowo-cytotoksyczne), CD19 i CD20 (limfocyty B). IgM są charakterystyczne dla dojrzałych limfocytów B. W pre-B łańcuchy μ są w cytoplazmie. Rozróżniamy barwiąc fluoresceiną, a po utrwaleniu (gdy błony stają się przepuszczalne dla białek) - rodaminą.
Test transformacji blastycznej: pozwala określić ogólny stan czynnościowy limfocytów oraz wykryć ogólne defekty układu immunologicznego zależne od wad jego komórek; transformacja blastyczna to zjawisko polegające na przechodzeniu limfocytów dojrzałych w formy niedojrzale pod wpływem stymulacji swoistej (antygeny np. oczyszczona tuberkulina PPD, anatoksyna tężcowa, anatoksyna błonicza, LPS bakteryjny, surowice antylimfocytarne i antyimmunoglobulinowe) lub nieswoistej (czynniki mitogenne, czyli lektyny np. metodą izotopową (opartą na pomiarze inkorporacji do kwasów nukleinowych radioaktywnie znakowanej tymidyny lub białek, np.
Cytofluorymetria Przepływowa
Cytofluorymetria przepływowa - służy do wieloparametrowej oceny komórek znajdujących się w zawiesinie, które są kierowane do kanału w strumieniu cieczy formowanym siłami hydrodynamicznymi (warunki przepływu dobrane tak, by komórki przepływały pojedynczo).
Wiązka światła (niebieskie lub ultrafioletowe) oświetla komórki i wzbudza fluorescencje, jeśli były one wyznakowane znacznikami fluorescencyjnymi. Detektory odbierają światło ugięte, rozproszone i fluorescencyjne.
tags: #aglutynacja #bierna #odwrócona #zasada #działania
